貨號(hào)：12830-50

△實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先逐一檢查試劑!

保存：組分室溫（15-30℃）保存。

操作步驟

1、加入 0.25g 糞便或生物固體到 Dry Bead Tube 中。
注意：水分、多糖和蛋白含量較高的糞便樣品（如胎便、某些鳥(niǎo)類(lèi)糞便）減少加樣量（0.1g）能提高 DNA 得率和純度。

2、加入 750μl Bead Solution 到 Dry Bead Tube 中。輕輕渦旋混勻。
這一步發(fā)生了什么：把樣品加入到 Bead Tube 后，下一步就是樣品均質(zhì)化和細(xì)胞裂解。石榴石研磨珠和裂解裂解緩沖液可溶解和把樣品分散開(kāi)。

3、使用前先檢查 C1 溶液。若有沉淀，60℃水浴直至全部溶解。
這一步發(fā)生了什么：C1 溶液含有 SDS。溫度較低時(shí)會(huì)在瓶底形成白色沉淀。60℃水浴可重新溶解 SDS，并且對(duì)SDS 和其它組分性能無(wú)損�？沙脽崾褂谩�

4、加入 60μl C1 溶液，上下顛倒數(shù)次或輕輕渦旋混勻。
這一步發(fā)生了什么：C1 溶液含有 SDS 和其它裂解試劑可輔助細(xì)胞裂解。SDS 是種去垢劑，可降解細(xì)胞膜上的脂肪酸和油脂。

5、65℃水浴加熱 10min。
這一步發(fā)生了什么：糞便樣品雜合了許多多糖、脂類(lèi)、鹽和細(xì)胞等。加熱可加快裂解緩沖液與這些物質(zhì)的反應(yīng)速度，輔助裂解細(xì)胞。

6、把 Bead Tubes 水平放置到渦旋儀適配器上（MOBIO 貨號(hào)：13000-V1-24）。最大轉(zhuǎn)速連續(xù)渦旋振蕩 10min。
這一步發(fā)生了什么：研磨珠與微生物細(xì)胞在裂解試劑包圍下震蕩，可使細(xì)胞破裂。MOBIO 的渦旋儀適配器是個(gè)簡(jiǎn)單而有效的附件，在渦旋振蕩過(guò)程中能把 Tube 管牢牢卡在渦旋儀上。你也可以用膠帶把 Tube 管固定在適配器上，但有可能在振蕩過(guò)程中松脫，影響樣品間條件一致性，降低得率。

7、13000g 離心 1min。

8、把上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的 2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。約可獲得 400-500μl 上清。
這一步發(fā)生了什么：這一步約可獲得 400-500μl 上清液。預(yù)期的體積與樣品起始量有關(guān)，不影響提取效率。

9、加入 250μl C2 溶液，輕輕渦旋混勻。4℃孵育 5min。
這一步發(fā)生了什么：C2 溶液為專(zhuān)利的 Inhibitor Removal Technology®（IRT）的一部分。它含有可沉淀多糖、細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)等非 DNA 的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)的試劑。這些有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)會(huì)影響 DNA 純度并抑制下游實(shí)驗(yàn)，必須去除。

10、13000g 離心 1min。

11、避開(kāi)沉淀，最多只轉(zhuǎn)移 600μl 上清到一個(gè)干凈的 2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。
這一步發(fā)生了什么：沉淀為多糖、細(xì)胞碎片、蛋白等非 DNA 有機(jī)和無(wú)機(jī)成分。為獲得最佳 DNA 得率和質(zhì)量，轉(zhuǎn)移上清時(shí)避開(kāi)沉淀。

12、加入 200μl C3 溶液，輕輕渦旋。4℃孵育 5min。13、13000g 離心 1min。

14、避開(kāi)沉淀，轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)干凈的 2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。轉(zhuǎn)移的上清液不能超過(guò) 750μl。
這一步發(fā)生了什么：沉淀為多糖、細(xì)胞碎片、蛋白等非 DNA 有機(jī)和無(wú)機(jī)成分。為獲得最佳 DNA 得率和質(zhì)量，轉(zhuǎn)移上清時(shí)避開(kāi)沉淀。轉(zhuǎn)移的上清不能超過(guò) 750μl，否則會(huì)影響后續(xù) DNA 的吸附綁定。

15、C4 溶液使用前先搖勻。加入 1200μl C4 溶液到上清中，渦旋 5s 混勻。
這一步發(fā)生了什么：C4 溶液為高濃度鹽溶液�？勺� DNA 牢牢地選擇性吸附到硅膠濾膜上，非 DNA 的有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)不被吸附，但仍會(huì)少量殘留在濾膜上。

16、加載 650μl 上清到一個(gè) Spin Filter 中，13000g 離心 1min。棄去濾液，重復(fù)加載上清。

注意：一共需要加載 3 次上清。

高通量選項(xiàng)：一次要處理大量樣品時(shí)，步驟 16 會(huì)變得非常耗時(shí)。因此 MOBIO 開(kāi)發(fā)出了真空泵抽吸法。需要額外購(gòu)買(mǎi)真空泵適配器（MOBIO 貨號(hào)：11992）。平底 Spin filter 在真空泵適配器幫助下能快速完成濾過(guò)動(dòng)作。

這一步發(fā)生了什么：DNA 在高濃度鹽環(huán)境下選擇性地吸附到離心柱硅膠濾膜上。雜質(zhì)通過(guò)濾膜，剩下 DNA 留在濾膜上。

17、加入 500μl C5 溶液，13000g 離心 1min。
這一步發(fā)生了什么：C5 是含有酒精的沖洗緩沖液，可進(jìn)一步?jīng)_洗離心柱硅膠濾膜上的 DNA。沖洗緩沖液還能去除硅濾膜上殘留的少量含和其它雜質(zhì)。

18、棄去濾液。
這一步發(fā)生了什么：濾液不含 DNA。

19、13000g 再次離心 1min。
這一步發(fā)生了什么：再次離心去除殘留的 C5 溶液（含有酒精的沖洗緩沖液）。含有酒精的 C5 溶液必須全部去除掉，以免影響后續(xù) PCR、消化、凝膠電泳等 DNA 應(yīng)用。

20、小心把 Spin Filter 轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的 2ml Collection Tube（試劑盒提供）中。避免沾到任何 C5 溶液。

21、加入 100μl C6 溶液到離心柱白色濾膜中心。你也可以用滅菌 DNA-Free PCR 級(jí)純水或 TE 緩沖液從硅膠離心柱上洗脫 DNA。

注意：用 100μl C6 溶液可獲得最佳的 DNA 得率。為了濃縮 DNA，C6 溶液使用量最少可以只加 50μl。C6 溶液用量少于 50μl 會(huì)嚴(yán)重影響洗脫效率。

這一步發(fā)生了什么：把 C6 溶液（滅菌洗脫緩沖液）加到離心柱白色濾膜中心，并潤(rùn)濕整個(gè)濾膜才能獲得最佳洗脫效果。C6 溶液（洗脫緩沖液）通過(guò)濾膜，DNA 在高濃度鹽環(huán)境下選擇性吸附到濾膜上，在 C6 溶液（10mM Tris）低鹽環(huán)境下洗脫下來(lái)。

22、13000g 離心 1min，棄去 Spin Filter。此時(shí) Tube 管中的 DNA 可直接用于下游實(shí)驗(yàn)，無(wú)需進(jìn)一步處理。DNA建議-20℃~-80℃冷凍保存。C6 溶液不含 EDTA。要濃縮 DNA，可參考下文疑難點(diǎn)。

感謝選用 PowerFecal™ DNA Isolation Kit!

疑點(diǎn)難點(diǎn)

樣品處理量

本試劑盒設(shè)計(jì)每次提取 0.25g 糞便樣品。我們不推薦加樣超過(guò) 0.25g。含有大量蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和多糖的某些糞便樣品，較少的加樣量（0.1g）可提高 DNA 得率和純度。

含水量較大的糞便樣品

若糞便樣品含有較多水分，可把樣品加入到 Bead tube 以后，10000g 離心 30s。抽掉所有游離水分。接著步驟 2 繼續(xù)。