豬瘟病毒抗體檢測試劑盒使用說明
豬瘟病毒抗體檢測試劑盒
Classical Swine Fever Virus Antibody Test Kit （CSFV Ab）
概述
豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉性病毒（BVDV）以及邊界�。˙DV）都屬于黃病毒屬的成員。由于CSFV的高致病力和高致死率，它已給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。豬感染高致病力毒株后在潛伏期就可以造成傳染，經(jīng)歷急性豬瘟或亞急性豬瘟臨床癥狀的豬在出現(xiàn)癥狀前大量排毒，但耐過后的豬只體內(nèi)有明顯的CSFV抗體，且不再排毒。感染溫和性毒株的豬呈慢性感染，在病死前會長期或間歇性地排毒。懷孕母豬可以通過胎盤感染胎兒導致流產(chǎn)、木乃伊化或產(chǎn)出弱豬、畸形胎等。先天性感染低毒力病毒的結(jié)果是產(chǎn)出持續(xù)性感染的仔豬，仔豬出現(xiàn)免疫耐受，不表現(xiàn)任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染BVDV或BDV。盡管這些感染通常呈溫和過程并且是自限性的，但有效的將它們同豬瘟病毒區(qū)分是很重要的。
原理
豬瘟病毒抗體ELISA檢測試劑盒是用來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的檢測試劑盒。該試劑盒是用豬瘟病毒抗原包被的微量反應(yīng)板，利用阻斷ELISA原理來檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體。如果被檢樣品中存在豬瘟病毒抗體，它們就會阻斷辣根過氧化物酶標記（HRPO）的抗豬瘟病毒的單克隆抗體。單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的結(jié)合可以通過辣根過氧化物酶與底物的顯色程度進行判定，即用酶標儀在單波長450nm或雙波長450nm與620nm測定該反應(yīng)體系的吸光度。當被檢樣品中含有豬瘟病毒抗體（陽性結(jié)果）時，顯色就會變淺，當被檢樣品中不含有抗豬瘟病毒抗體（陰性結(jié)果）時，顯色就會變深。樣本的阻斷率可以通過450nm波長樣本吸光度與陰性對照吸光度的比值來確定
試劑
一個ELISA反應(yīng)板可以檢測92份樣品（另加兩個對照，每個雙孔），或46個未知樣品，每個樣品加雙孔。雙孔檢測法有利于檢測結(jié)果的準確性。
1. 用豬瘟病毒抗原包被的ELISA反應(yīng)板
2. 洗滌液（10×）
3. 陰性對照
4. 陽性對照
5. 樣品稀釋液
6. 辣根過氧化物酶標記（HRPO）的抗豬瘟病毒的單克隆抗體
7. TMB底物
8. 終止液
自備器材
1．微量移液器，50μl和100μl。
2．一次性微量移液器使用的吸頭。
3．蒸餾水或去離子水。
4．洗板用的洗瓶或洗板機。
5．溫箱或微量反應(yīng)板用的封條。
6．酶標儀。
注意事項
1．要認真閱讀操作說明，按操作說明進行操作。
2．試劑盒及試劑盒中的所有試劑要保存在2~7℃。
3．沒有用過的微量反應(yīng)板必須密封于塑料袋中并保存在2~7℃。
4．不同批次的試劑或說明書不可混合使用。
5．使用處理各個試劑時要小心，嚴防細菌和真菌對試劑的污染。
6．禁止使用過期的試劑。
7．在處理樣本和試劑盒中的試劑時禁止吃食物、喝水和吸煙等。
8．各個樣本使用不同的吸頭，以防污染。
9．每次檢測都要加陽性對照和陰性對照。
10．稀釋各種試劑組分時只能使用超純水。
11．底物溶液對眼睛、皮膚以及呼吸系統(tǒng)都有刺激作用，在使用過程中要防止該溶液接觸眼睛和皮膚。
12．終止液中含有強酸HCl,容易引發(fā)燒傷，處理該溶液時一定要小心謹慎。
13．用吸量管吸取液體時禁止用嘴。
14．該試劑盒僅用于體外檢測。
試劑準備
包被的微量反應(yīng)板，樣品稀釋液，陽性對照，陰性對照，酶標二抗，底物溶液和終止液使用前無需處理。
洗滌液（10×）濃縮的洗滌液在使用前必須用超純水進行10倍稀釋。被稀釋了的洗滌液可以在4℃的條件下保存3天，或冰凍條件下保存一年。如：250ml 的洗滌液需用25ml的濃縮洗滌液和225ml的超純水充分混合配成而成。注意：如果濃縮液中含有結(jié)晶，在使用之前必須將它融化，應(yīng)將該液溫水浴30分鐘以上。
樣品準備
新鮮的、冷藏（4°C 少于8 天）的、冰凍的血清或血漿都可以用于檢測。
操作步驟
1．在使用時，所有的試劑盒組分都必須恢復到室溫18~25℃。使用前應(yīng)將各組分放置于室溫至少一小時。
2．分別將50μl 樣品稀釋液加入每個檢測孔和對照孔中。
3．分別將50μl 的陽性對照和陰性對照加入相應(yīng)的對照孔中，注意不同對照的吸頭要更換，以防污染。
4．分別將50μl 的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防污染。
5．輕彈微量反應(yīng)板或用振蕩器振蕩，將反應(yīng)板中的溶液混勻。
6．將微量反應(yīng)板用封條封閉或于濕箱中（18~25℃）孵育2 小時，也可以將微量反應(yīng)板用封條封閉或于濕箱中孵育過夜。
7．吸出反應(yīng)孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3 次，注意每次洗滌時都要將洗滌液加滿反應(yīng)孔， 棄去反應(yīng)孔中的洗滌液并拍干反應(yīng)板。也可以用洗板機洗滌3 次，每個反應(yīng)孔應(yīng)加300μl 左右的洗滌液。注意洗板時要小心，以免樣本之間的交叉污染。
8．分別將100μl 的抗-CSFV 酶標二抗（即取即用）加入反應(yīng)孔中，用封條封閉反應(yīng)板并于室溫下或濕箱中孵育30 分鐘。
9．洗板（見6）后，分別將100μl 的底物溶液加入反應(yīng)孔中，并于避光、室溫條件下放置10 分鐘。加完第一孔后即可計時。
10．在每個反應(yīng)孔中加入100μl 的終止液終止反應(yīng)。注意要按加酶標二抗的順序加終止液。
11．在450nm 處測定樣本以及對照的吸光度值，也可用雙波長（450nm 和620nm）測定樣本以及對照的吸光度值，空氣調(diào)零。
12．計算樣本和對照的平均吸光度值（見計算）。
計算方法
計算被檢樣本的平均值OD450（＝ODTEST）、陽性對照的平均值（＝ODPOS）、陰性對照的平均值（＝ODNEG）。
根據(jù)以下公式計算被檢樣本和陽性對照的阻斷率；（陽性對照阻斷率以同樣方法計算）
ODNEG － ODTEST
阻斷率＝ ————————× 100%
ODNEG 3
試驗有效性
陰性對照的平均OD450應(yīng)大于0.50。陽性對照的阻斷率應(yīng)大于50％。
結(jié)果判定
如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40％，該樣本就可以被判為陽性（有CSFV抗體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30％，該樣本就可以被判為陰性（無抗CSFV抗體存在）。如果被檢樣本的阻斷率在30~40％之間，就應(yīng)在數(shù)日后再對該動物進行重測。
如果重測結(jié)果仍為可疑，就應(yīng)用血清中和實驗方法鑒定。請參照本國相關(guān)的有效規(guī)章。
