研究結(jié)果

1 dek10導(dǎo)致籽粒變小以及發(fā)育遲緩

        dek10-ref (dek10-N1176A)突變體來(lái)源于玉米種質(zhì)中心。該突變體在獲得后與W22野生型進(jìn)行雜交進(jìn)行背景純化，并且表型觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dek10百粒重只有野生型的27%，總蛋白與胚乳重量顯著下降。然而，淀粉卻沒(méi)有顯著變化。對(duì)植株的觀察發(fā)現(xiàn)，dek10植株的發(fā)育速度比野生型顯著降低（圖1）。

2 dek10的圖位克隆

在植物正向遺傳學(xué)中，獲得突變體后往往需要對(duì)基因進(jìn)行定位與克隆。在此，研究人員使用圖位克隆的方法對(duì)dek10基因進(jìn)行精細(xì)定位。在對(duì)947個(gè)F2代突變體種子進(jìn)行鑒定后，研究人員將dek10基因定位于InDel-AC204567.28與InDel-GRMZM2G071304.4范圍內(nèi)。該段范圍由225K個(gè)堿基組成，包含2個(gè)BAC克�。ˋC204567與AC186864）。其中包含了8個(gè)可能的候選基因，根據(jù)對(duì)這8個(gè)基因的序列分析發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G087226中有一段5個(gè)堿基CCTCC的插入，導(dǎo)致移碼突變（圖2）。

為了確認(rèn)圖位克隆的準(zhǔn)確性，研究人員還使用了等位測(cè)試的方法對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，該候選基因的CRISPR/Cas9突變體與dek10的等位突變雜交后，不能使其恢復(fù)野生型表型。證實(shí)了該基因就是dek10的突變基因。

3 dek10編碼了一個(gè)定位于線粒體的E族PPR蛋白

根據(jù)對(duì)dek10的進(jìn)化樹(shù)分析以及BLASTP分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼了一個(gè)E族PPR蛋白（圖3）。此外，對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位表明，該蛋白定位于線粒體。  

4 Dek10對(duì)線粒體nad3-61、nad3-62與cox2-550中的RNA編輯

有文獻(xiàn)報(bào)道，E族PPR蛋白參與了對(duì)RNA的編輯。對(duì)dek10突變體大量的線粒體轉(zhuǎn)錄本測(cè)序配合測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)dek10突變體中特異的可變剪切位點(diǎn)：nad3 61與62以及cox2的550。導(dǎo)致了nad3蛋白對(duì)應(yīng)氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦�氨酸，cox2蛋白絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦�氨酸（圖4）。
 

5 dek10影響線粒體相關(guān)基因表達(dá)

為了對(duì)dek10突變對(duì)籽粒線粒體的影響有一個(gè)廣泛的認(rèn)識(shí)，研究人員還對(duì)dek10突變體進(jìn)行了RNA測(cè)序，以期望能夠獲得足夠的信息，了解dek10可能的具體分子機(jī)制。在此，通過(guò)RNA測(cè)序，研究人員鑒定到了48480個(gè)基因，其中包含2668個(gè)差異基因。在這些基因中，420個(gè)表現(xiàn)為表達(dá)量下降。其中，736個(gè)基因具有功能標(biāo)注。GO富集分析后，差異基因的功能主要被歸類(lèi)到GO: 0005740 (Mitochondrial envelope, p-value=5.0E-18); GO: 0015078 (Hydrogen ion transmembrane transporter activity, p-value=1.3E-13); 與GO: 0015992 (Proton transport, p-value= 7.0E-06)上(圖5）。  

6 dek10影響線粒體形態(tài)

最后，研究人員為了對(duì)dek10突變后線粒體在形態(tài)上有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，將dek10 18DAP的胚乳進(jìn)行了未成熟籽粒的透射電鏡觀察。結(jié)果表明，dek10突變后，線粒體體積顯著增大，并且呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)（圖5）。

該研究中RNA-seq服務(wù)由伯豪生物提供。

原文出處： Qi WW, Tian ZR, Lu L, Chen XZ, Chen XZ, Zhang W, Song RT.
Editing of mitochondrial transcripts nad3 and cox2 by Dek10 is essential for mitochondrial function and maize plant development. Genetics. 2017.