玻璃化凍存技術(shù)——成功解決活腫瘤組織凍存復(fù)蘇難題，助力活腫瘤樣本庫(kù)建設(shè)和腫瘤精準(zhǔn)治療

玻璃化凍存技術(shù)成功突破了活腫瘤組織凍存復(fù)蘇后存活率低的難題，使得凍存的腫瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期保存腫瘤組織活性，組織復(fù)蘇后可維持與新鮮腫瘤組織幾乎相同的形態(tài)特征和功能。

1、活腫瘤組織樣本庫(kù)的意義

活體組織特別是活腫瘤組織，具有重要的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值，活組織保存技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這些價(jià)值的基礎(chǔ)。 常用的活腫瘤組織保存方法主要為建立PDX腫瘤模型保存和凍存。建立PDX腫瘤模型保存，耗時(shí)耗力，程序繁瑣，費(fèi)用昂貴，且經(jīng)過多次傳代后，腫瘤組織容易發(fā)生變異，腫瘤組織異質(zhì)性喪失，失去保存的價(jià)值。 

活腫瘤組織凍存即將組織置于低溫環(huán)境中保存，以使組織暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)，保存腫瘤組織的特性。這樣的保存方式省心省力，操作簡(jiǎn)便，且成本低廉。在需要的時(shí)候才將組織復(fù)蘇移植，使之以原代腫瘤形態(tài)增殖，很好地保存了腫瘤的原始突變，可獲得分子、細(xì)胞、組織及體內(nèi)等多水平的全面的腫瘤信息數(shù)據(jù)。

2、現(xiàn)有活腫瘤組織凍存技術(shù)——腫瘤組織凍存復(fù)蘇后存活率低

以往的新鮮的活腫瘤組織采用的凍存方式與細(xì)胞凍存類似，一般為程序降溫凍存，組織凍存液一般由DMSO、血清、細(xì)胞培養(yǎng)液組成，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。但是由于血清的成分不定，凍存液的穩(wěn)定性差，使得這種組織凍存液的保質(zhì)期較短，保存條件也較為苛刻。

使用現(xiàn)有的組織凍存液凍存腫瘤組織時(shí)，只有極少數(shù)的腫瘤組織可以復(fù)蘇或以腫瘤細(xì)胞的形式進(jìn)行傳代，更無法以原代腫瘤的形態(tài)增殖，且極易丟失腫瘤的原始突變，只能獲得分子水平的數(shù)據(jù)信息。故而，現(xiàn)有的組織凍存液的應(yīng)用范圍狹窄，降低了腫瘤組織樣本的應(yīng)用價(jià)值和科研轉(zhuǎn)化能力。

3、玻璃化凍存技術(shù)——長(zhǎng)期保存腫瘤組織活性

最近，我們采用玻璃化技術(shù)成功突破了活腫瘤組織凍存復(fù)蘇難題，應(yīng)用該技術(shù)凍存的腫瘤組織可長(zhǎng)期保存腫瘤組織活性，組織復(fù)蘇后可維持與新鮮腫瘤組織幾乎相同的形態(tài)特征和功能，該技術(shù)的具體特點(diǎn)是：

• 凍存后可長(zhǎng)期保存（>10年）。
• 復(fù)蘇后形態(tài)功能與新鮮組織一致。
• 復(fù)蘇后仍可分離原代腫瘤細(xì)胞。
• 凍存前后PDX成瘤能力基本不變。
• 可替代冰凍切片和石蠟固定組織。
• 實(shí)現(xiàn)DNA、RNA和蛋白活性保存。
• 手術(shù)標(biāo)本、活檢組織均適用。

4、活腫瘤組織樣本庫(kù)的應(yīng)用

腫瘤精準(zhǔn)治療的臨床前評(píng)價(jià)

近兩年來，腫瘤精準(zhǔn)治療理念已深入人心，免疫治療和靶向藥物取得一定突破，但目前手術(shù)和放化療仍然是主要治療方式，其中腫瘤化療已成為常規(guī)治療手段。然而，由于腫瘤異質(zhì)性極大，同一種化療方案在不同病人間的治療反應(yīng)可能迥異，因此如何評(píng)價(jià)和選擇合適的化療方案，一直是困擾臨床醫(yī)生和病人的主要矛盾。

雖然前期研究人員采用原代腫瘤細(xì)胞或組織球在評(píng)價(jià)腫瘤藥物中取得了一定進(jìn)展，但這兩種方法均需要對(duì)腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞分離，一方面體積較小的腫瘤無法獲得足夠的細(xì)胞進(jìn)行研究，另一方面由于分離的腫瘤細(xì)胞脫離了腫瘤組織微環(huán)境，其測(cè)試的結(jié)果也往往不能真實(shí)反映腫瘤對(duì)藥物的敏感性。因此，近幾年在國(guó)外對(duì)腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)的研究日益受到關(guān)注。研究標(biāo)明，0.2-0.3毫米的薄層腫瘤組織切片可充分保證其在培養(yǎng)基中對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和物質(zhì)交換。在優(yōu)化的培養(yǎng)基和特殊的支持物上，腫瘤組織切片可存活7天以上，完全可滿足體外藥物篩查的要求。與原代腫瘤細(xì)胞或組織球相比，薄層腫瘤組織切片需要的組織體積較小，且保留了完整的腫瘤組織結(jié)構(gòu)，通過體外培養(yǎng)結(jié)合化療藥物處理，可真實(shí)高效的反映腫瘤對(duì)藥物的敏感性。我們的前期研究標(biāo)明，凍存復(fù)蘇的腫瘤組織可保留新鮮組織70-80%的活性，經(jīng)體外腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)測(cè)試，與新鮮腫瘤組織切片具有完全相同的藥物反應(yīng)性，可為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者提供實(shí)時(shí)的腫瘤藥物敏感性測(cè)試。

此外，凍存復(fù)蘇的活腫瘤組織還可用于建立PDX模型（人源性腫瘤動(dòng)物模型），由于高度模擬患者腫瘤的生物特征，PDX模型被認(rèn)為是最好的腫瘤研究和治療評(píng)價(jià)模型，用于藥物研發(fā)、測(cè)試和生物標(biāo)志物鑒定。理想的活腫瘤組織應(yīng)當(dāng)直接來源于患者，由于PDX模型鼠的建立操作程序復(fù)雜繁瑣、運(yùn)行成本高昂，因此只有少量患者腫瘤組織能被利用。而使用活腫瘤組織凍存技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)腫瘤組織的即時(shí)凍存和隨時(shí)復(fù)蘇，與PDX模型結(jié)合，可為腫瘤治療的臨床前評(píng)價(jià)提供體內(nèi)評(píng)價(jià)模型。因此，活腫瘤組織凍存為腫瘤組織薄層切片培養(yǎng)和PDX模型建立提供了可能，也為腫瘤精準(zhǔn)治療提供了全新的思路。

腫瘤研究的珍貴資源和有效工具

以往的腫瘤組織樣本庫(kù)保存的都是“死”的腫瘤組織，如速凍組織和組織蠟塊等，僅能提供DNA、RNA和蛋白等“靜態(tài)”信息，腫瘤一旦凍存即無法“復(fù)活”，無法獲得腫瘤的“動(dòng)態(tài)”信息。由于腫瘤存在極大異質(zhì)性，且腫瘤組織一直處于進(jìn)化過程中，靜態(tài)和固定化信息不能真實(shí)反映腫瘤的變化規(guī)律。另一方面，隨著腫瘤研究的快速發(fā)展，新的治療藥物和手段層出不窮，急需“活“的腫瘤組織進(jìn)行研究和測(cè)試，因此活腫瘤組織凍存和復(fù)蘇技術(shù)的突破，為腫瘤研究提供了全新的資源和手段。