研究背景

結(jié)核分枝桿菌是最成功的胞內(nèi)病原體之一。其在感染宿主時(shí)能夠被巨噬細(xì)胞所吞噬，進(jìn)而形成吞噬體。吞噬體可以進(jìn)一步的破壞入侵的病原體。但是結(jié)核分枝桿菌可以通過(guò)一系列的過(guò)程來(lái)避免吞噬體的消滅，進(jìn)而來(lái)破壞宿主細(xì)胞。

研究思路

研究結(jié)果

1、 WhiB6調(diào)控與ESX-1分泌系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)

海魚(yú)分枝桿菌的MMAR_5437基因（與結(jié)核分枝桿菌的WhiB6同源）保守地存在于ESX-1基因附近。通過(guò)比對(duì)海魚(yú)分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的ESX-1基因簇發(fā)現(xiàn)，其ORF序列和基因結(jié)構(gòu)都是高度保守的 (Figure 1A)。推測(cè)WhiB6是否可以調(diào)控ESX-1系統(tǒng)的基因表達(dá)。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在WhiB6敲除株中，ESX-1系統(tǒng)相關(guān)基因pe35,espE,esxA, 和esxB的表達(dá)量都發(fā)生了顯著的下調(diào)（Figure1B）。為了進(jìn)一步研究WhiB6是否可以調(diào)控ESX-1相關(guān)基因的表達(dá)，作者做了chip實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， espA, whiB6, espE,和eccA1基因的啟動(dòng)子區(qū)域在野生型Mm(WT)和互補(bǔ)株MB6 中得到了顯著的富集（相對(duì)于WhiB6突變株和互補(bǔ)空載體株 (Figure 1C)。進(jìn)一步研究WhiB6是否可以進(jìn)行自身的調(diào)控。WT野生株和WhiB6突變株轉(zhuǎn)入含有分別來(lái)自于Mm, MtbH37Rv, 和MtbCDC1551 菌株的融合有egfp熒光標(biāo)簽的WhiB6啟動(dòng)子的質(zhì)粒。熒光定量結(jié)果顯示，在Mm和MtbCDC1551菌株熒光強(qiáng)度顯著增高，而MtbH37Rv菌株則沒(méi)有（Figure 1D）。Mm菌株的RT-PCR也同樣證實(shí)了這個(gè)結(jié)果（Figure 1E）。

2、 WhiB6 Fe-S 簇對(duì)ESX-1的功能起著重要的作用

      通過(guò)比對(duì)Mm菌株和Mtb菌株的WhiB6 蛋白的序列發(fā)現(xiàn)，它們具有高度的相似性(Figure 2A)。WhiB6蛋白中的四個(gè)保守的Cys殘基 (i.e., Mm菌株中的Cys-14, 33, 36,和Mtb菌株中的Cys-34, 53, 56, and 62 inMtb)是非常保守的(Figure 2B)。先前研究發(fā)現(xiàn)，ESX-1與溶血相關(guān)。因此作者進(jìn)行了溶血實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WhiB6突變株與野生株相比，溶血性下降 ，而互補(bǔ)株的溶血性又發(fā)生恢復(fù)。此外，所有對(duì)Cys進(jìn)行突變了的分枝桿菌的溶血性都發(fā)生了顯著的下降（Figure 2C）。此外， 在WhiB6突變株中，ESAT-6 (EsxA)和CFP-10 (EsxB) 的含量也發(fā)生了減少，而在互補(bǔ)株中其含量又得到了恢復(fù)（Figure 2D）。同樣地，在WhiB6突變株中，ESX-1相關(guān)基因的表達(dá)量也發(fā)生了下降（Figure 2E）。以上這些結(jié)果表明，WhiB6的Fe-S對(duì)于調(diào)控ESX-1是非常重要的。

3、 破壞WhiB6的Fe-S簇可以調(diào)控Mm的轉(zhuǎn)錄模式（轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析由上海伯豪完成）

      為了進(jìn)一步確認(rèn)MB6和MB6-4CS具有不同生長(zhǎng)表型的原因，作者檢測(cè)了與代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況(Figure 3A)。其中，編碼與細(xì)胞色素c通路的電子轉(zhuǎn)移鏈bc1復(fù)合物（qcrCAB），aa3型細(xì)胞色素c氧化酶（ctaBCDE）和細(xì)胞色素bd（cydABCD）的表達(dá)量在MB6中顯著下調(diào)。同樣地，編碼F0F1 ATP合成酶的基因的表達(dá)量也發(fā)生了下降。相反，上述基因的大部分的表達(dá)量在MB6-4CS中出現(xiàn)了上調(diào)(Figure 3A)。有趣的是，與細(xì)胞壁合成相關(guān)基因操縱子相關(guān)的基因的表達(dá)量在MB6中出現(xiàn)了顯著的下調(diào)(Figure 3A)。在MB6-C14S和MB6-4CS中，Dos休眠基因 (i.e., devH(mmar_1515)-devR-devS operon)和hspXandtgs1相對(duì)于MB6組都出現(xiàn)了顯著的誘導(dǎo)表達(dá) (Figure 3B)。在TB6-C34S和TB6-4CS中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。總之,這些研究結(jié)果指向一個(gè)假肢切換機(jī)制，憑借獨(dú)立于apo-WhiB6之外的WhiB6 Fe-S簇可以調(diào)控基因的表達(dá)。更特別的是，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，WhiB6 Fe-S 簇可以對(duì)dos 調(diào)節(jié)子進(jìn)行負(fù)調(diào)控以及對(duì)ESX-1分泌系統(tǒng)進(jìn)行正調(diào)控。

4、 WhiB6 與NO反應(yīng)后可以動(dòng)態(tài)調(diào)控ESX-1和Dos 休眠基因的表達(dá)

      作者添加EDTA-NO后，可以導(dǎo)致在420nm/480nm的吸光度減少，而在300-320nm處的吸光度增加（Figure 4A）。這個(gè)結(jié)果表明了DNICs的形成。與大部分WhiB蛋白家族相似，WhiB6同樣可以與NO發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而形成亞硝化 Fe-S簇。為了進(jìn)一步研究亞硝化WhiB6對(duì)ESX-1和DosR表達(dá)的調(diào)控，作者使用EDTA-NO對(duì)MB6, TB6, 和DwhiB6-vec菌株進(jìn)行不同時(shí)間的處理來(lái)模擬活化的巨噬細(xì)胞的狀態(tài)，然后觀察WhiB6的表達(dá)(Figure 4B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NO可以誘導(dǎo)whiB6的表達(dá)，而其mRNA水平在處理60min后出現(xiàn)了減少 (Figure 4B)。devH-devR-devS操縱子的第一個(gè)基因devH的表達(dá)情況在MB6 和TB6中相對(duì)于whiB6-vec隨著時(shí)間的變化出現(xiàn)了增加(Figure 4C)。但是這些差異表達(dá)在3小時(shí)后逐漸減少(Figure 4C)，表明NO和WhiB6以及DosR之間存在著一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過(guò)程。假定esxB是WhiB6調(diào)控ESX-1分泌系統(tǒng)中起著決定性作用。作者發(fā)現(xiàn)，在TB6 和MB6菌株中esxB基因的表達(dá)量在NO處理30分鐘后出現(xiàn)了顯著被誘導(dǎo)，而在60分鐘后出現(xiàn)下降（Figure 4D）。有趣的是，在TB6 和MB6菌株中，NO處理3小時(shí)后，esxB被顯著的激活 (Figure 4D)。當(dāng)用300 uM的EDTA-NO處理MB6菌株時(shí)，EsxA和EsxB的分泌出現(xiàn)了顯著的降低。這個(gè)結(jié)果表明，NO可以誘導(dǎo)ESX-1分泌系統(tǒng)的下調(diào)。

5、 Isoforms of WhiB6 亞型可以調(diào)控Mm的毒力以及在斑馬魚(yú)中肉芽腫的形成

      基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測(cè)，WhiB6可以參與到肉芽腫的形成。為了確認(rèn)此假設(shè)，作者檢測(cè)了Mm菌株的毒力（5,000 cfu）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)斑馬魚(yú)感染了MB6和TB6的互補(bǔ)菌株后，他們會(huì)出現(xiàn)高的死亡率（Figure 5A），而感染了MB6-4CS 和TB6-4CS卻出現(xiàn)了生存率升高的情況。感染了WT, whiB6突變株,和whiB6-vec（突變株+空載體）也有相同生存率。接下來(lái)，為了確定這些疾病的死亡是否是由MB6 和MB6-4CS 形成的肉芽腫引起的，作者又檢測(cè)了肉芽腫的形成動(dòng)力學(xué)。在感染2周后（WT和whiB6突變株），巨噬細(xì)胞聚集，肉芽腫出現(xiàn) (Figures 5B and 5D)。斑馬魚(yú)感染4周后，肉芽腫更加豐富， 但是有較少的一致的排列不規(guī)則的多中心壞死區(qū) (Figures 5C和5E)。 MB6和TB6 可以加速壞死并且加速破壞肉芽腫(Figures 5G和5J)。相反，空載體組就有排列完好的單一中心的壞死的肉芽腫(Figure 5F)。但是當(dāng)斑馬魚(yú)感染了MB6-4CS和TB6-4CS后，只能觀察到很少的肉芽腫，并且只有少數(shù)的壞死區(qū)(Figures 5H and 5K)。感染4周后, MB6-4CS和TB6-4CS 菌株還能形成排列完好的肉芽腫，并且還有分枝桿菌存在 (Figures 5I 和5L)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，WhiB6不僅能調(diào)控分枝桿菌的毒力，還能調(diào)控壞死肉芽腫形成的持續(xù)時(shí)間。

      為了研究MB6，MB6-4CS和whiB6突變株（空載體）共感染是否能增加細(xì)菌的生存率，以及增加感染的傳播，3個(gè)菌株被兩兩結(jié)合來(lái)進(jìn)行下一步的研究。當(dāng)與MB6進(jìn)行共感染4周后，在斑馬魚(yú)的幼體的頭部發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的存在 (Figures 6C and 6D)。相反，同時(shí)感染MB6-4CS和whiB6突變株（空載體）的斑馬魚(yú)中的幾乎50%的頭部在感染4周后發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌，但是在7周后沒(méi)有(Figure 6D)。在MB6-4CS和whiB6突變株（空載體）感染7周后，可以檢測(cè)到細(xì)菌的熒光顯著的減少(Figure 6E)。因此，結(jié)果表明，WhiB6的壓型可以調(diào)控毒力和肉芽腫的形成，并且可以調(diào)控Mm在斑馬魚(yú)中的復(fù)制和傳播。 

總結(jié)

WhiB6 可以通過(guò)Fe-S簇來(lái)差異性的調(diào)控ESX-1和DosR調(diào)節(jié)子。本實(shí)驗(yàn)也為研究WhiB6在分枝桿菌的感染，傳播和疾病發(fā)展中的作用提供了新的思路。

原文出處：Chen Z, Hu Y, Cumming BM, et al. Mycobacterial WhiB6 Differentially Regulates ESX-1 and the Dos Regulon to Modulate Granuloma Formation and Virulence in Zebrafish. Cell Rep.2016.