高鹽飲食對更年期焦慮小鼠海馬鉀離子 - 氯離子共轉(zhuǎn)運體 2、鈉 - 鉀 - 氯離子失轉(zhuǎn)運體 1 表達的影響

【摘 要】目的 研究高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運體 1( NKCC1) 表達的影響。方法 將大鼠隨機分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。其中 4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組經(jīng)高鹽飲食干預(yù) 1個月后，HE 染色觀察腦部結(jié)構(gòu)，免疫組織化學(xué)觀察 KCC2、NKCC1 表達情況。結(jié)果 高鹽飲食使更年期焦慮小鼠海馬區(qū)錐體細胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞間隙明顯增大; 模型組 KCC2 表達的陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少; 模型組 NKCC1表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯。結(jié)論 高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與 KCC2 及 NKCC1 之間的動態(tài)平衡被打破有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 高鹽飲食; 更年期焦慮癥; 鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運體 2; 鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運體 1

更年期焦慮癥不僅影響患者的健康、社會關(guān)系、家庭生活等方面，還可引起其他精神障礙疾病，甚至產(chǎn)生自殺行為，且直接關(guān)系到老年期疾病的發(fā)生。因此其防治研究是臨床醫(yī)護人員乃至整個社會所面臨的重要任務(wù)。隨著年齡增長，人們味覺功能下降，在日常生活中表現(xiàn)為食物咸味重，研究表明我國人均吃鹽及人均每天食鹽攝入量均超標(biāo)。本研究探討高鹽飲食對更年期焦慮小鼠鉀離子-氯離子共轉(zhuǎn)運體 2( KCC2) 、鈉-鉀-氯離子共轉(zhuǎn)運體 1( NKCC1) 的影響。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物 選用 11 月齡的昆明雌性小鼠，清潔級，體重35 ～ 45 g，由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部代購，動物合格證號: scxk( 湘) 2009-0012。飼料均來自于由長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部。

1. 2 試劑與儀器 羊抗鼠 KCC2、NKCC1 多克隆抗體購自美國Sigma公司。低溫大容量高速離心機( 型號: KDC-2046 低溫大容量離心機，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實業(yè)有限公司) ; 電子天平( 型號: ES-C-600 電子天平，湘儀天平儀器有限公司) 。

1. 3 分組 連續(xù) 5 d 進行小鼠陰道涂片檢查，呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的小鼠為自然更年期小鼠。將 40 只更年期小鼠隨機分為空白組、模型組、4% 高鹽飲食組、8% 高鹽飲食組。分組后空白組和模型組小鼠繼續(xù)給予普通飼料，4% 高鹽飲食組小鼠予含 4% 的 Na Cl 高鹽顆粒飼料，8% 高鹽飲食組小鼠予含 8% 的Na Cl 高鹽顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，自由飲用自來水，連續(xù) 1個月。

1. 4 實驗儀器 ①高架十字迷宮模型②明暗箱③曠場實驗均由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1. 5 HE 染色 實驗第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī) HE 染色，脫水透明封固，制成切片，光學(xué)顯微鏡觀察。

1. 6 免疫組織化學(xué) 實驗第 31 天取材，麻醉灌注取腦，4% 多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、包埋，選擇海馬部位冠狀位連續(xù)冷凍切片。以 SABC 法 進 行 免 疫 組 織 化 學(xué): 加 入 0. 3% H2O210 min，3% 正常山羊血清封閉 10 min; 滴加一抗( 1 ∶ 100) ，過夜( 陰性對照組以正常羊血清替代一抗) ，加入羊抗兔 Ig G、SABC，室溫放置 2 h，PBS 沖洗鋪片，DAB 顯色劑顯色，脫水，封片。每只大鼠取 3 張切片，每張切片選取 3 個無重疊在顯微鏡( ×400) 下觀察海馬區(qū) NKCC1、KCC2 的表達情況。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)方法 組間比較行 t 檢驗。

2 結(jié) 果

2. 1 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦部結(jié)構(gòu)的影響

空白組海馬區(qū)細胞排列整齊，細胞核圓而大，核仁清晰可見，錐體細胞排列整齊，層次緊密; 模型組海馬區(qū)錐體細胞排列較紊亂，神經(jīng)元數(shù)目減少，細胞輪廓較清晰，出現(xiàn)空泡現(xiàn)象，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞間隙相對增大; 高鹽飲食組海馬區(qū)錐體細胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，細胞輪廓模糊，出現(xiàn)大量的空泡現(xiàn)象，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞間隙明顯增大，8% 高鹽飲食組表現(xiàn)比 4%高鹽飲食組更明顯。

2. 2 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬 KCC2 表達的影響

在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 KCC2 表達陽性細胞明顯減少，高鹽飲食組陽性細胞極少，且 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

2. 3 高鹽飲食對更年期焦慮癥小鼠腦海馬 NKCC1 表達的影響

在高倍光學(xué)顯微鏡下，觀察視野范圍內(nèi)細胞陽性著色情況，與空白組比較，模型組 NKCC1 表達陽性細胞明顯增多，高鹽飲食組陽性細胞增多更明顯，但 4% 和 8% 高鹽組之間沒有明顯的差異。

討 論

合理的飲食結(jié)構(gòu)是現(xiàn)代中醫(yī)護理中飲食護理的中心內(nèi)容之一。目前提倡合理的飲食結(jié)構(gòu)，雖根據(jù)每個人的機體狀況而有所不同，但總體而言首先應(yīng)避免偏嗜。早古代醫(yī)家就已強調(diào)飲食不宜過咸，應(yīng)少吃鹽�，F(xiàn)代文獻也報道食物與人的情緒有關(guān)，如多食咸味、甘味，使鹽、糖攝入過多，情緒容易激動。澳大利亞學(xué)者曾歷時 10 年的跟蹤調(diào)查結(jié)果顯示，飲食結(jié)構(gòu)與抑郁、焦慮等精神紊亂之間存在密切的關(guān)系。KCC2 分布于神經(jīng)元細胞膜上的轉(zhuǎn)運蛋白，是神經(jīng)元細胞內(nèi)氯離子外排的主要因素，使 Cl－由細胞內(nèi)移向細胞外，降低胞內(nèi)的 Cl－濃度; NKCC1 分布于上皮細胞和非上皮細胞膜上，則順著內(nèi)向 Na 梯度促使 Cl－由細胞外移向細胞內(nèi)，促進細胞內(nèi)Cl－堆積，故 Cl－排出系統(tǒng)( KCC2) 及 Cl－聚集系統(tǒng)( NKCC1) 之間的動態(tài)平衡決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)中〔Cl－〕i。γ-氨基丁酸( GA-BA) 產(chǎn)生興奮性和抑制性作用之間的進行轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素在神經(jīng)元細胞 內(nèi) Cl－濃 度 差，而 功 能 相 反 的 氯 離 子 共 轉(zhuǎn) 運 體KCC2 / NKCC1 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)調(diào)節(jié) Cl－濃度差、調(diào)控 GABA效應(yīng)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。研究表明，KCC2 基因敲除的大鼠，其腦內(nèi) GABA 的抑制作用下降。NKCC1 mＲNA 表達增高及KCC2mＲNA 表達降低的變化可能引起神經(jīng)元細胞內(nèi) Cl－濃度增高，Cl－梯度的崩潰，Cl－內(nèi)流減少，細胞膜超級化減弱，從而導(dǎo)致 GABA 能抑制作用的減弱，神經(jīng)元高興奮性，使癲癇易感性增加。課題研究前期采用 EPM、高架十字迷宮成功制備焦慮癥模型，且高鹽飲食可加重動物焦慮程度，減少其活動次數(shù)，本研究結(jié)果顯示高鹽飲食加重更年期焦慮癥的發(fā)生可能與高鹽飲食使細胞內(nèi)外的 Na+、Cl－水平發(fā)生改變，KCC2 及NKCC1 之間的動態(tài)平衡被打破，但具體機制有待進一步研究。