聯(lián)合服用色氨酸對(duì)氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響

【摘要】 目的探討聯(lián)合服用色氨酸對(duì)氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響。方法將60只雄性Wistar大鼠按隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、色氨酸組、氟西汀組和色氨酸+氟西汀組，各15只。對(duì)照組大鼠給予9 g／L氯化鈉注射液灌胃(5 mtAg)，色氨酸組給予50 mg／kg色氨酸，氟西汀組給予10 mg／kg氟西汀，色氨酸+氟西汀組同時(shí)給予大鼠50 mg／kg色氨酸和10 mg／kg氟西汀灌胃。4組大鼠均給予21 d長期慢性、中等和不可預(yù)知應(yīng)激刺激建立抑郁模型。采用改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)檢測4組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間及攀爬時(shí)間。采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)檢測4組大鼠進(jìn)入開放臂、閉合臂時(shí)間，進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間及進(jìn)入開放臂次數(shù)占總次數(shù)百分比。高效液相色譜法測定4組大鼠腦脊液中色氨酸水平。 結(jié)果 (1)4組大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間、游泳時(shí)間、攀爬時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。氟西汀和色氨酸均對(duì)大鼠改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)有顯著影響。(2)4 組大鼠進(jìn)入開放臂時(shí)間、進(jìn)入閉合臂和中央?yún)^(qū)的時(shí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義釁0．05)。氟西汀對(duì)大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)有顯著影響。色氨酸對(duì)大鼠進(jìn)入各臂與中央?yún)^(qū)的次數(shù)、時(shí)間無顯著影響。氟西汀和色氨酸聯(lián)用對(duì)大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)行為學(xué)指標(biāo)的影響不存在顯著交互作用。(3)4組大鼠腦脊液中色氨酸水平測定結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_6．874，P=-O．002)。色氨酸+氟西汀組大鼠腦脊液中色氨酸水平顯著高于對(duì)照組及色氨酸組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(氏0．05)。 結(jié)論(1)色氨酸可加重大鼠抑郁樣行為，對(duì)焦慮行為無明顯作用；(2)氟西汀可逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為，但致焦慮；(3)色氨酸和氟西汀聯(lián)合使用對(duì)治療大鼠焦慮樣行為、抑郁樣行為無明顯效果。

【關(guān)鍵詞】色氨酸； 氟西��；抑郁；焦慮； 交互作用

抑郁癥是一種以顯著而持久情緒低落為特征的情感性精神障礙，具有高患病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率和高自殺率特點(diǎn)，嚴(yán)重危害著人類身心健康。研究表明5一羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是情緒性行為的重要調(diào)節(jié)因子，其功能異�？赡軈⑴c抑郁癥發(fā)病機(jī)制。目前。選擇性5-HT重吸收抑制劑(SSRIs)，如氟西汀等，是治療抑郁癥的首選藥物；但這類藥物療效不佳、治療周期長、副反應(yīng)多和復(fù)發(fā)率高。因此，亟待開發(fā)新型抑郁癥防治藥物。近年來研究表明口服色氨酸可增加5-HT的合成．促進(jìn)5-HT能系統(tǒng)功能的恢復(fù)。故本研究通過觀察抑郁模型大鼠服用色氨酸聯(lián)合氟西汀后的行為與生化變化以探討色氨酸聯(lián)合氟西汀治療抑郁的療效。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑、儀器

健康成年雄性Wistar大鼠60只，8周齡，體質(zhì)量230—280 g，由華北煤炭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，室溫(22±1)℃，濕度(55±5)％，光暗周期12／12h，可自由攝食、飲水。大鼠于實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按隨機(jī)區(qū)組法將大鼠分為對(duì)照組、色氨酸組、氟西汀組和色氨酸+氟西汀組，各15只。L．色氨酸購自上�？颠_(dá)氨基酸廠：鹽酸氟西汀原料藥購自西安萬昌生物科技有限公司；SupelcosilLC．18色譜柱(250 mmx4．6 mnl，5斗m)購自上海楚定分析儀器有限公司；Eppendorf5408R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司。

二、抑郁模型大鼠的建立

給予4組大鼠21 d長期慢性、中等和不可預(yù)知應(yīng)激刺激，包括電擊足底(電壓40V，20 s／次，間隔50 S，共20次)、熱應(yīng)激(45℃，5 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、夾尾(1 min)、晝夜顛倒、禁食(48 h)、禁水(24 h)。每日隨機(jī)給予一種刺激，且相同刺激不可連續(xù)出現(xiàn)。

三、給藥方法

刺激期間同時(shí)給予大鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)42 d。對(duì)照組大鼠給予9 g／L氯化鈉注射液(5mE&g)灌胃，色氨酸組給予50 mg／kg色氨酸，氟西汀組給予10 mg／kg氟西汀，色氨酸+氟西汀組同時(shí)給予大鼠50 mg／kg色氨酸和10 mg／kg氟西汀灌胃。

四、行為學(xué)指標(biāo)觀察

1．改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)（上海欣軟公司提供）：連續(xù)灌胃給藥42 d后，將大鼠禁食12 h后置于底部直徑21 cm、高50 cm的透明圓柱形游泳桶中，水溫(25±1)℃，水深30cm，強(qiáng)迫游泳15 min后將其從泳池中取出．擦干并放回飼養(yǎng)籠。24 h后，將大鼠再次置于游泳桶中，連續(xù)觀察并錄像5 min，分析大鼠靜止不動(dòng)、游泳和攀爬的時(shí)間。

2．高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（上海欣軟公司提供）：末次給藥后第2天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。裝置由2條相對(duì)閉合臂(50 cm×10 cm)和2條相對(duì)開放臂(50 cm×10 cm)連接組成一個(gè)帶有中央?yún)^(qū)(10 cmxl0 cm)的方形結(jié)構(gòu)，4條臂均為黑色．距離地面43 cm。將大鼠置于安靜、黑暗的敞箱中自由活動(dòng)5 min，隨后將其從中央?yún)^(qū)面向開放臂放入．連續(xù)觀察5 min，記錄進(jìn)入開放臂時(shí)間、次數(shù)及進(jìn)入閉合臂時(shí)間、次數(shù)等資料。

五、腦脊液樣本采集

首次給藥4 h后，大鼠腹腔注射20％烏拉坦(1．2g／kg)麻醉，俯臥置于動(dòng)物固定架上，在大鼠的枕骨大孔正中線上，順平行其頭部彎曲的角度，將1 mL注射器刺入其小腦延髓池，吸取50～60汕L腦脊液，10 000xg離心5 min。取上清保存于一70℃環(huán)境中。

六、高效液相色譜法測定色氨酸濃度

腦脊液樣品用鄰苯二甲醛衍生化反應(yīng)后．采用高效液相色譜法分離。色譜柱為Supelcosil LC一18(250 mmx4．6 mm，5¨m)，流動(dòng)相A為0．04 mol／L一水磷酸二氫鈉(pH5．5)，含20％(體積百分比)甲醇；流動(dòng)相B為0．01 mol／L一水磷酸二氫鈉(pH5．5)，含80％(體積百分比)甲醇；用二元梯度洗脫，流速1．4mL／min，柱溫24℃，進(jìn)樣量50斗L。熒光檢測器激發(fā)波長360 nln，發(fā)射波長455 nlTI，以外標(biāo)法定量。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSl3．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差6蜘)表示。采用單因素方差分析法對(duì)大鼠行為學(xué)指標(biāo)和腦脊液色氨酸水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。若色氨酸和氟西汀抗大鼠抑郁、焦慮樣行為的療效存在顯著交互作用，則進(jìn)行ANOVA簡單效應(yīng)檢驗(yàn)，組間比較采用LSD．t法；若交互作用不顯著，則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較色氨酸+氟西汀組與對(duì)照組差異。當(dāng)P<0．05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討論

5-HT為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，參與情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)和記憶。5-HT系統(tǒng)功能低下是抑郁癥發(fā)病的重要機(jī)制，色氨酸是5-HT合成的限制因素，色氨酸不能自由通過血腦屏障。需經(jīng)非特異性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸至腦內(nèi)，但外周色氨酸濃度可影響中樞內(nèi)色氨酸的可利用度。因此基于5-HT能系統(tǒng)調(diào)節(jié)情緒和行為的假設(shè)，El服色氨酸可增加腦內(nèi)5-HT水平。本研究觀察聯(lián)合服用色氨酸對(duì)氟西汀治療抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的影響。

根據(jù)改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，色氨酸顯著增加大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間，減少攀爬時(shí)間，同時(shí)顯示出減少游泳時(shí)間的趨勢，因此具有加重大鼠抑郁樣行為的作用，這可能與色氨酸使用劑量有關(guān)。當(dāng)色氨酸濃度未達(dá)到需要時(shí)可限制5-HT合成，導(dǎo)致腦內(nèi)5一HT水平無法增加海馬神經(jīng)前體細(xì)胞或加強(qiáng)神經(jīng)元再生，抑郁加重。研究表明，色氨酸攝入受限將增加大鼠在改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中靜止不動(dòng)時(shí)間。且這種抑郁樣行為可能與5-HT能系統(tǒng)活性降低有關(guān)。本研究結(jié)果也顯示．在不限制飲食且不消耗內(nèi)源性5-HT的情況下．大鼠口服色氨酸對(duì)5-HT能系統(tǒng)活性無正面效應(yīng)。氟西汀顯著減少靜止不動(dòng)時(shí)間，增加游泳時(shí)間．具有逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為的作用，這與其可抑制突觸前膜對(duì)5一HT的再攝取，增加神經(jīng)細(xì)胞突觸間隙5-HT水平．增強(qiáng)其情緒調(diào)節(jié)有關(guān)。

根據(jù)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，色氨酸對(duì)大鼠焦慮行為無顯著作用，而氟西汀則具有致焦慮作用。多數(shù)相關(guān)研究均顯示氟西汀可增加大腦細(xì)胞外5-HT水平。本研究關(guān)于氟西汀具有逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為以及致焦慮作用的研究結(jié)果，與其他研究者的結(jié)果一致。然而，另一些研究顯示氟西汀具有抗焦慮作用。造成研究結(jié)論與本文不一致的原因可能與給藥劑量不同有關(guān)。根據(jù)這些研究的治療效果．本研究中氟西汀給藥量選擇為10 mg／(kg·d)，屬于較高劑量。目前，有關(guān)色氨酸減緩抑郁的研究尚無一致結(jié)論。聯(lián)合服用色氨酸對(duì)氟西汀逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為無顯著促進(jìn)作用。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)色氨酸和氟西汀對(duì)大鼠靜止不動(dòng)時(shí)間的影響存在一定的交互作用。提示腦脊液中色氨酸水平升高可能抵消了氟西汀逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為的作用。此外，聯(lián)合服用色氨酸和氟西汀對(duì)大鼠的焦慮行為無顯著改善作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，色氨酸聯(lián)合氟西汀、齊美利定、氯丙咪嗪或阿密曲替林治療對(duì)抑郁模型大鼠抑郁、焦慮樣行為的改善作用并不穩(wěn)定。但Cervo等研究顯示。預(yù)先給予色氨酸可使2種耐西酞普蘭的小鼠對(duì)西酞普蘭增敏。

本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)服用色氨酸或氟西汀對(duì)大鼠腦脊液色氨酸水平無顯著影響；然而，聯(lián)合服用色氨酸和氟西汀大鼠腦脊液中的色氨酸水平較對(duì)照組顯著升高。推測與色氨酸和氟西汀對(duì)大鼠腦脊液中色氨酸水平的影響存在顯著交互作用有關(guān)。色氨酸經(jīng)色氨酸羥化酶(TPH)轉(zhuǎn)化為5一羥色氨酸(5．HTP)，再經(jīng)5-HTP脫羧酶轉(zhuǎn)化為5-HT。氟西汀不但可增加神經(jīng)細(xì)胞間隙的5-HT濃度．同時(shí)Shishkina等研究顯示氟西汀可上調(diào)大鼠大腦TPH．2酶mRNA水平，可增加色氨酸非特異性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的水平，使其運(yùn)輸至腦內(nèi)濃度增加，因此聯(lián)合用藥時(shí)大鼠腦脊液中色氨酸濃度增加。然而。本研究結(jié)果表明色氨酸和氟西汀聯(lián)用在逆轉(zhuǎn)抑郁模型大鼠抑郁方面無協(xié)同作用。推測是由于長期用藥以及改良強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)影響了與5-HT合成以及代謝過程相關(guān)的酶的表達(dá)和活性。

綜上所述。聯(lián)合服用色氨酸對(duì)氟西汀逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為無顯著促進(jìn)作用，并且對(duì)大鼠焦慮樣行為也無明顯改善作用。