復(fù)方抗焦慮膠囊對急性應(yīng)激大鼠的抗焦慮作用及對大鼠腦內(nèi)ERK/CREB信號通路和BDNF表達的影響

摘要:目的研究復(fù)方抗焦慮膠囊對急性應(yīng)激大鼠的藥效及其對大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號通路、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的影響。方法采用高架十字迷宮實驗,觀察了復(fù)方抗焦慮膠囊低、中、高劑量(0．75、1．5、3g·kg-1)給藥7d對急性應(yīng)激大鼠行為的影響,采用Westernblot免疫印跡法研究復(fù)方抗焦慮膠囊對ERK/CREB信號通路的影響,對急性應(yīng)激大鼠腦皮層及海馬BDNF表達的影響。結(jié)果高架十字迷宮實驗顯示,復(fù)方抗焦慮膠囊高劑量組可明顯增加大鼠進入開臂時間的百分數(shù)(OT%)(P<0．05)和進入開臂次數(shù)的百分數(shù)(OE%)(P<0．05)。Westernblot實驗顯示,復(fù)方抗焦慮膠囊中劑量組明顯減少了海馬中p-ERK1/2的表達(P<0．05);高劑量組明顯減少了大鼠皮層和海馬中p-ERK1/2和p-CREB的表達(P<0．05)。高劑量組明顯增加了大鼠皮層及海馬中BDNF的表達水平(P<0．05,P<0．01)。結(jié)論復(fù)方抗焦慮膠囊在高架十字迷宮模型中具有抗焦慮作用,且其抗焦慮機制可能與影響ERK/CREB信號通路,增加BDNF表達有關(guān)系。

關(guān)鍵詞:復(fù)方抗焦慮膠囊;急性應(yīng)激;高架十字迷宮;ERK/CREB信號通路;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF);Westernblot免疫印跡法

焦慮癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的精神疾病,成為日益增長的全球健康問題。焦慮癥以急性焦慮反復(fù)發(fā)作為特征,臨床表現(xiàn)為廣泛性焦慮和發(fā)作性驚恐狀態(tài)2種形式。臨床上以恐懼、緊張不安等精神障礙為主要表現(xiàn),并伴有心悸、多汗、胸悶、呼吸窘迫以及睡眠障礙等。在精神障礙中,焦慮癥的終生患病率最高,影響到30%人口的壽命。在我國,焦慮癥已成為現(xiàn)代常見病和多發(fā)病,嚴重影響了人們的生活質(zhì)量。因此,焦慮癥的有效治療成為亟待解決的問題。

苯二氮卓類藥物已被證明是有效的抗焦慮藥,如地西泮等,但這些化合物存在明顯的副作用,如鎮(zhèn)靜、肌肉松弛、遺忘和依賴性。并且抗焦慮藥物的服藥時程長,易導(dǎo)致戒斷反應(yīng)、反跳和依賴。臨床證實,中藥治療焦慮癥不僅安全有效、副作用小,還具有改善其它相關(guān)癥狀的作用。因此,研究開發(fā)療效好、副作用小的中藥抗焦慮新藥成為近些年來研究的熱點。

復(fù)方抗焦慮膠囊(antianxieticcompoundprescriptioncapsule,ACPC)來源于臨床經(jīng)驗方,由蜘蛛香、合歡皮、炒酸棗仁、燈心草組成,功能理氣解郁、養(yǎng)血安神,主要治療肝郁氣滯、心神不寧型焦慮癥。前期研究表明,該復(fù)方具有穩(wěn)定的抗焦慮作用,且不影響動物的自主行為活動,其作用機制與調(diào)節(jié)GABAA受體[9-10]、Cdk5/p35通路的表達,抑制腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及調(diào)節(jié)免疫功能紊亂相關(guān)。為了更加深入地對復(fù)方抗焦慮膠囊的藥效進行評價,明確其作用特點,為其安全有效的應(yīng)用提供實驗和理論依據(jù),本實驗探討了復(fù)方抗焦慮膠囊對急性應(yīng)激大鼠的作用及其機制。

1材料

1.1動物SPF級SD♂大鼠,體質(zhì)量150~170g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(京)(2012-0001)。

1.2藥品與試劑①蜘蛛香藥材購自云南省師宗縣,炒酸棗仁、合歡皮和燈心草購于河北省安國市藺氏有限責(zé)任公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定,蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香ValerianajatamansiJones的干燥根莖及根;酸棗仁為鼠李科棗屬植物酸棗ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥種子;合歡皮為豆科植物合歡AlbizziajulibrissinDurazz.的樹皮;燈心草為燈心草科植物燈心草JuncuseffusesL.的干燥莖髓。蜘蛛香、炒酸棗仁、合歡皮、燈心草(均為干浸膏)按照12∶9∶9∶1的質(zhì)量比混合,再加入0.5倍干膏量的糊精混勻,制成顆粒,干燥,分裝,即得復(fù)方抗焦慮膠囊(含橙皮苷1．05mg·g-1、酸棗仁皂苷A7.50mg·g-1),實驗前用氯化鈉注射液將其制成溶液備用。②地西泮(diazepam,DZP),2．5mg×20片,國藥準字H11020898,北京益民藥業(yè)有限公司,批號20120305。③氯化鈉注射液,國藥準字H37020764,山東齊都藥業(yè)有限公司,批號1012081004。④RIPA裂解液、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺、膜再生液、封閉用脫脂奶粉均購自北京普利萊生物科技有限公司;過硫酸銨(ammoniumpersulphate,AP)為美國Amersco公司產(chǎn)品;甲叉雙丙稀酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,SDS)為美國Sigma公司產(chǎn)品;三氨基甲烷(Tris)、甘氨酸購自美國Novon公司;p-ERK1/2、ERK1/2、pCREB和CREB抗體為CellSignaling公司產(chǎn)品;β-actin單克隆抗體為SantaCruz公司產(chǎn)品;HRP標記山羊抗兔及兔抗山羊二抗均為中杉金橋公司產(chǎn)品;ECL發(fā)光檢測試劑盒及光譜彩虹預(yù)染蛋白Marker均為康為公司產(chǎn)品;PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品;其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器

1.3.1高架十字迷宮大鼠高架十字迷宮(XR-XG201型上海欣軟公司)包括兩個閉臂(50．9cm,寬10．4cm,高40．9cm)與兩個開臂(50．9cm,寬10．4cm),距地面74．3cm。

1.3.2束縛管聚乙烯材料束縛管自制(規(guī)格:長22．6cm,直徑7．9cm)。

1.3.3Westernblot免疫印跡實驗儀器超聲勻漿機(USASonic公司)、高速冷凍離心機(BeckmanAllegra64R)、移液器(1000、200、100、20μL)(德國Eppendorf公司)、UNIC7200型分光光度儀(上海UNIC公司)、-80℃低溫冰箱(Forma,美國)、垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置(美國Bio-Rad公司)、恒溫水浴搖床(上海比朗儀器有限公司)、多用脫色搖床、多功能酶標儀(美國MultiskanEXPRIMA-RYEIAV.2．3)。

2方法

2.1造模與分組大鼠單籠飼養(yǎng),將大鼠隨機分為空白組、模型組、膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性藥物組,共6組,每組8只。其中低、中、高劑量組分別按0．75、1．5、3g·kg-1·d-1給予灌胃,DZP組給予1．0mg·kg-1·d-1灌胃,空白組和模型組灌服等容積的生理鹽水,連續(xù)7d灌胃給藥,d5、6、7除空白組外,其他各組在給予藥物后進行急性應(yīng)激造模。于d5各組灌胃后,參照文獻[12]造模方法并對其進行相應(yīng)改進,除空白對照組外的其余各組動物放進束縛裝置,束縛管只限制大鼠的活動范圍,對其呼吸并無抑制。束縛期間禁食禁水,束縛結(jié)束后恢復(fù)自由。每次刺激30min,每日1次,連續(xù)3d。d7給藥束縛后,進行高架十字迷宮測試。

2.2對急性應(yīng)激大鼠高架十字迷宮行為的影響迷宮測試前,將每只大鼠放入一個45cm×30cm×15cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM的中央平臺處,使其頭部正對其中一個開放臂,采用紅外線技術(shù)記錄5min內(nèi)大鼠的活動情況。每次測試完成后,用紙巾清除糞便,隨后濕布蘸取酒精擦拭迷宮,繼而用干布擦凈后再進行下一只大鼠的測試。記錄5min內(nèi)動物進入開臂次數(shù)(openarmentry,OE)、閉臂次數(shù)(closearmentry,CE)及迷宮中央?yún)^(qū)內(nèi)的次數(shù)及在開臂與閉臂內(nèi)的運動時間。以進入開臂次數(shù)與總?cè)氡鄞螖?shù)的百分比(thepercentageofentriestotheopenarms,OE%)及在開臂內(nèi)運動時間與開臂閉臂內(nèi)的總時間的百分比(thepercentage oftimespentintheopenarms,OT%)代表抗焦慮作用指標。

2.3Westernblot檢測急性應(yīng)激大鼠腦皮層及海馬ERK/CREB信號通路和BDNF的表達

2.3.1取材大鼠急性應(yīng)激EPM實驗結(jié)束后,立即斷頭處死,迅速取出大腦,于冰盤上快速分離出海馬及皮層,隨后于-80℃低溫冰箱中凍存待用。

2.3.2組織裂解取約200mg海馬或皮層組織,加入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液冰浴超聲3×4s,4℃下12000r·min-1離心10min后吸取上清,采用Bradford法測定蛋白濃度后分裝,立即95℃煮10min使蛋白變性,防止蛋白降解,煮后的蛋白可-20℃保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

2.3.3Westernblot測定按Westernblot方法測定p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB和CREB蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的表達,目的蛋白表達量與內(nèi)參蛋白表達量的比值作為組織內(nèi)蛋白的相對表達水平。Westernblot具體操作步驟如下:灌膠與上樣:配制12%分離膠,加水封膠。分離膠凝固后將水盡量倒干凈,用濾紙吸干分離膠殘留的水,配制5%的濃縮膠,灌入制膠板,插入樣品梳。待到濃縮膠凝固后,取出樣品梳。加入50μg蛋白的上樣樣品至1．5mL離心管中,加入5×loadingbuffer上樣緩沖液至終濃度為1×,加足量的runningbuffer后上樣。

電泳:110V電壓恒壓電泳2h,電泳至溴酚蘭即將跑出,即可終止電泳,停止電泳,拆開膠板,棄去濃縮膠,取出分離膠。

轉(zhuǎn)膜操作:將PVDF膜在無水甲醇中浸泡至膜變成灰色透明,馬上取出,放入去離子水中浸泡2min,隨即放入預(yù)冷的1×轉(zhuǎn)膜Buffer中浸泡,浸泡凝膠30min,濾紙、海綿20min,以1×轉(zhuǎn)膜Buffer注滿電轉(zhuǎn)膜槽,接通電泳儀,以0．23mA電流恒流轉(zhuǎn)膜1h。

免疫反應(yīng):將膜用TBST從下向上浸濕后,移至含有封閉液的保鮮盒中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1h后,4℃冰箱封閉過夜。將p-ERK1/2、ERK1/2、p-CREB、CREB與β-actin蛋白抗體以1×TBST稀釋(1∶1000),將膜蛋白面朝下放于抗體液面上,4℃冰箱中孵育過夜。然后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min。同上方法二抗結(jié)合(1∶8000),室溫下孵育1h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10min,隨后進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

化學(xué)發(fā)光、顯影、定影:取ECL發(fā)光工作液A和B兩種試劑各500μL混合后,將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸1min,將膜用保鮮膜包好后移至X光壓片夾后,進入暗室曝光X片。曝光結(jié)束后,放入顯影液中顯影并定影,自來水沖去殘留的定影液后,室溫下晾干。

凝膠圖像分析:將膠片進行掃描拍照,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS16．0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,計量數(shù)據(jù)使用x■±s表示。多組間比較采用(One-wayANOVA)單因素方差分析,兩兩比較方差齊時采用LSD檢驗法,方差不齊時采用Dunnett’sT3進行兩兩比較。

4討論

束縛應(yīng)激是一種有效的焦慮應(yīng)激模型,通過數(shù)次強度、時間一致的束縛之后,可誘發(fā)動物出現(xiàn)排尿排便增多、修飾行為明顯增多等行為指標,同時,還會影響體內(nèi)激素及內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化,這些生理反應(yīng)正是焦慮患者體內(nèi)的生理變化。

生物學(xué)研究認為,調(diào)節(jié)正常和病理性焦慮狀態(tài)的神經(jīng)生物學(xué)通路異常是導(dǎo)致焦慮障礙的原因。而海馬和皮層中ERK-CERB信號通路被認為可能與焦慮有關(guān)。研究表明,焦慮大鼠腦內(nèi)p-ERK1/2含量明顯增加,且PD98059阻斷其磷酸化后,可產(chǎn)生明顯抗焦慮的作用。Meller等發(fā)現(xiàn),急慢性束縛應(yīng)激可引起大鼠海馬中p-ERK1/2的不同變化,大鼠急性束縛30min后,海馬中p-ERK1/2含量明顯增加,慢性束縛應(yīng)激11d后,海馬中p-ERK1/2含量明顯減少。CREB轉(zhuǎn)錄因子的基因表達和對緊張、焦慮的潛在作用也被廣泛研究,Lu等研究表明,28d慢性應(yīng)激大鼠海馬中p-ERK1/2與p-CREB的含量均明顯減少。然而,也有研究表明14d壓力誘導(dǎo)大鼠海馬中的p-ERK1/2與p-CREB的含量均升高。通過以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),不同時間應(yīng)激對p-ERK1/2與p-CREB的含量調(diào)控是雙向的。本實驗對大鼠采用3d急性束縛應(yīng)激,束縛大鼠表現(xiàn)為易受驚嚇、易激惹、被毛豎立;束縛組大鼠在高架十字迷宮模型中表現(xiàn)為排尿、排便次數(shù)增多,呈現(xiàn)焦慮狀,且與空白組相比,開臂時間與次數(shù)百分比明顯減少,提示3d造�？墒勾笫螽a(chǎn)生焦慮。

因此,本實驗對大鼠海馬和皮層中p-ERK1/2與p-CREB的含量進行測定,以明確復(fù)方抗焦慮膠囊對3d急性束縛應(yīng)激模型大鼠ERK-CERB信號通路的調(diào)節(jié)方式。實驗結(jié)果表明,束縛應(yīng)激會增強ERK-CREB通路的活化,導(dǎo)致磷酸化ERK和磷酸化CREB含量的增加,而地西泮和復(fù)方抗焦慮膠囊會抑制ERK-CREB過度的磷酸化,提示復(fù)方抗焦慮膠囊可能通過影響ERK-CREB信號通路產(chǎn)生抗焦慮作用。

BDNF是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子,自1989年其cDNA結(jié)構(gòu)被闡明以來,對BDNF的分布及功能有了廣泛的深入研究。研究發(fā)現(xiàn),BDNF可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元和突觸的可塑性,對中樞神經(jīng)元的增殖和修護有巨大的意義,而焦慮癥的治療也與神經(jīng)元和突觸的形成有密切關(guān)系。本實驗結(jié)果表明,應(yīng)激模型導(dǎo)致大鼠皮層及海馬中BDNF明顯減少,而復(fù)方抗焦慮膠囊可以明顯抵消這種減少,從而對皮層和海馬產(chǎn)生保護作用。

ERK-CREB通路與BDNF蛋白的表達關(guān)系密切,ERK-CREB通路的變化可以影響BDNF蛋白的表達。BDNF蛋白參與急性焦慮信號。實驗結(jié)果表明,復(fù)方抗焦慮膠囊對ERK-CREB通路和BDNF蛋白的表達都有明顯的影響,表現(xiàn)為抑制ERK-CREB通路的磷酸化與增加BDNF的表達,因此提示膠囊可能通過調(diào)節(jié)它們的相互反應(yīng)而發(fā)揮其抗焦慮作用。

綜上所述,本實驗結(jié)果表明復(fù)方抗焦慮膠囊對急性應(yīng)激模型大鼠具有一定的抗焦慮作用,并且其作用機制可能與影響ERK-CREB信號通路及BDNF的表達有關(guān)系,但它們之間深層次的相互影響有待于進一步研究。