轉(zhuǎn)錄因子Sp9參與神經(jīng)紋狀體蒼白球發(fā)育過程
研究人員發(fā)現(xiàn)鋅指轉(zhuǎn)錄因子——Sp9,在LGE祖細(xì)胞中廣泛表達(dá),對維持有絲分裂期后的紋狀體蒼白球MSNs至關(guān)重要,為我們理解神經(jīng)元發(fā)育過程提供了新的證據(jù)。研究背景
紋狀體是基地神經(jīng)節(jié)的重要組成部分,是一類中型多棘神經(jīng)元(MSNs)。MSNs的兩個重要的基地神經(jīng)節(jié)亞型分別是紋狀體黑質(zhì)(直接通路)和紋狀體蒼白球(間接通路)。紋狀體中5%-10%的神經(jīng)細(xì)胞為多棘內(nèi)在神經(jīng)元。已有研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子(TFs)參與紋狀體黑質(zhì)MSNs的形成,但是TFs在紋狀體蒼白球MSNs形成過程中的作用還不清晰。本研究通過對一個鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子Sp9的深入研究,闡述了該轉(zhuǎn)錄因子在紋狀體蒼白球發(fā)育過程中的重要作用研究思路
研究結(jié)果
1. Sp9表達(dá)模式分析表明其在神經(jīng)紋狀體蒼白球中特異表達(dá)
為了系統(tǒng)性了解的轉(zhuǎn)錄因子Sp9在大腦中表達(dá)和功能,研究人員構(gòu)建了Sp9多克隆抗體和突變體alleles,Sp9-LacZ null allele(Sp9LacZ/+)和Sp9 floxed allele(Sp9Flox/+)。檢測顯示,Sp9-LacZ在E10.5期的神經(jīng)節(jié)(GEs)中廣泛表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和RNA雜交實(shí)驗(yàn)表明Sp9 RNA和蛋白在E13.5期的室下區(qū)域(SVE)和地幔區(qū)域的LGE,MGE和CGE區(qū)域廣泛表達(dá)。同時,在SVE的Sp9+細(xì)胞中,神經(jīng)前體蛋白Ascl1和細(xì)胞增殖marker Ki67也有明顯表達(dá)。在胚胎發(fā)育階段,Sp9在大部分的遷移皮質(zhì)神經(jīng)節(jié)中表達(dá)。
通過構(gòu)建Sp9-Cre knockin小鼠,研究人員發(fā)現(xiàn)Sp9+祖細(xì)胞產(chǎn)生了96%以上的皮層中間神經(jīng)元和VIP(腸血管活性肽)+亞型和幾乎所有的紋狀體中間神經(jīng)元。Foxp1是特異性的在有時分裂后期的MSNs細(xì)胞中表達(dá),結(jié)果顯示所有Foxp1+細(xì)胞中都有Sp9-Cre表達(dá),表明Sp9-Cre在紋狀體黑質(zhì)和紋狀體蒼白球MSNs中被激活。此外,研究人員也發(fā)現(xiàn)Sp9-Cre在嗅球細(xì)胞(OB)中間神經(jīng)元中表達(dá)。
通過Drd2-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠,研究人員構(gòu)建了Sp9紋狀體表達(dá)模型小鼠。結(jié)果顯示,Sp9在胎兒紋狀體中強(qiáng)烈表達(dá),一直持續(xù)到嬰兒時期。在E16.5,P0, P5,P17和P35期的紋狀體蒼白球中都表達(dá)Sp9。該結(jié)果表明,在MSNs有絲分裂期后,Sp9特異性地在紋狀體蒼白球MSNs中特異表達(dá)。
2. Sp9突變小鼠中紋狀體蒼白球MSNs的生成和凋亡受影響
為探究Sp9的生物學(xué)功能,研究人員對Sp9 Laz/Laz突變小鼠進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,突變體小鼠發(fā)育較弱,持續(xù)到P7還是發(fā)育無力,在P14開始死亡,在P22期已沒有存活的小鼠。同時,Sp9突變體小鼠的大腦大小和重量也都比正常的小。
表型分析顯示,Sp9突變體小鼠大腦紋狀體嚴(yán)重萎縮,在P9期體積是對照的54%。同時,相對于Sp9LacZ/+小鼠,Drd2-EGFP 小鼠中Foxp1+細(xì)胞減少57%,Sp9LacZ/LacZ小鼠中,F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+細(xì)胞減少了97%,且在紋狀體中非均勻分布。在背內(nèi)側(cè)紋狀體中,F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+細(xì)胞也很難檢測到,但出現(xiàn)在了側(cè)紋狀體中。對Drd2的原位雜交實(shí)驗(yàn)也確認(rèn)了該類細(xì)胞的缺失。此外,突變體小鼠的Enk+細(xì)胞嚴(yán)重減少,進(jìn)一步表明紋狀體蒼白球MSNs的缺失。只有很少的Drd2-GFP+細(xì)胞出現(xiàn)在背側(cè)紋狀體中,屬于中間神經(jīng)元亞型。另外,Drd1-GFP在紋狀體特異性的在黑質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),Sp9LacZ/LacZ突變體中紋狀體黑質(zhì)MSNs的GFP表達(dá)并沒有明顯變化。該結(jié)果表明,Sp9突變只影響了紋狀體蒼白球的發(fā)育。研究人員對E13.5和E15.5小鼠LGE進(jìn)行30-min BrdU 脈沖標(biāo)記。結(jié)果顯示,E13.5期突變體BrdU+細(xì)胞在SVZ中減少。E15.5期突變體中BrdU+細(xì)胞在SVZ祖細(xì)胞和SVZ Foxp1+有絲分裂期后MSNs中都減少。
研究人員接下來進(jìn)行了BrdU birth-dating分析。在E12.5期注射BrdU,在突變體和對照P0期統(tǒng)計BrdU+和BrdU+/Foxp1+細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)兩者都明顯減少。因此,缺失了Sp9影響了LGE SVZ的循環(huán)祖細(xì)胞的缺失。
對Sp9LacZ突變體中β-gal+和β-gal+/Foxp1+細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計,發(fā)現(xiàn)數(shù)量顯著減少。由于Sp9主要在紋狀體蒼白球細(xì)胞中表達(dá)。所以,Sp9的缺失影響了紋狀體蒼白球MSNs的產(chǎn)生。
對E16.5期的紋狀體MSNs中10個紋狀體MSN markers進(jìn)行原位RNA雜交檢測,發(fā)現(xiàn)5個紋狀體黑質(zhì)marker(Drd1,Tac1,Ebf1,Pdyn,Chrm4)和5個紋狀體蒼白球marker(Drd2, Penk, Gpr6, Adora2a, Ptprm)在Sp9LacZ/+controls中都表達(dá)。在Sp9 LacZ/LacZ突變體SVZ和紋狀體中,紋狀體蒼白球MSN markers顯著下調(diào),qRT-PCR結(jié)果也驗(yàn)證了該結(jié)果。但是,紋狀體黑質(zhì)markers表達(dá)沒有顯著影響。
對E16.5和P0期紋狀體Drd2-EGFP檢測,發(fā)現(xiàn)在突變體的SVE和紋狀體中,F(xiàn)oxp1+/Drd2-GFP+ MSD細(xì)胞更少。因此,這些結(jié)果都顯示,Sp9特異性地促進(jìn)紋狀體蒼白球MSNs的生成。
研究人員接下來分析了Caspase-3表達(dá),以檢測出生后Sp9LacZ/LacZ突變鼠紋狀體的細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示,突變體在出生后不同時間Caspase-3+細(xì)胞增加顯著大于對照。由于在Caspase-3+細(xì)胞中并沒有檢測到Drd2-GFP的表達(dá)和紋狀體黑質(zhì)MSNs的減少,所有在Sp9突變體紋狀體中,死亡的細(xì)胞為未成熟的紋狀體蒼白球MSNs。
為探究突變體紋狀體蒼白球 MSNs凋亡是否為Bcl-2-associated X 蛋白(Bax)-依賴,研究人員構(gòu)建了Sp9LacZ/LacZ; Bax-/-雙突變體。結(jié)果顯示,雙突變體在P3期紋狀體細(xì)胞死亡幾乎消失,F(xiàn)oxp1+細(xì)胞數(shù)量明顯高于單突。值得注意的是,這種增加的Foxp1+細(xì)胞并不能轉(zhuǎn)化成成熟的紋狀體蒼白球MSNs。因此,除了促進(jìn)LGE增殖和生成,Sp9還影響了紋狀體蒼白球神經(jīng)元的分化和成熟過程。
為進(jìn)一步分析Sp9對紋狀體蒼白球MSNs有絲分裂期后的作用,研究人員構(gòu)建了條件性敲除突變系Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox;Rosa-YFP+小鼠。突變體中的Foxp1+和Foxp1+/GFP+細(xì)胞明顯減少。在P0,P3和P5期條件性突變體Caspase-3+細(xì)胞數(shù)量也明顯上升。因此,Sp9條件性缺失突變體的Drd2+紋狀體蒼白球MSNs的缺失與細(xì)胞程序性死亡相關(guān),說明Sp9對于紋狀體蒼白球MSNs有絲分裂期后的生存相關(guān)。
那么,這種紋狀體蒼白球MSNs的缺失會造成什么樣的生理問題呢?結(jié)果顯示,條件性突變小鼠的移動能力受到了影響,表現(xiàn)出更強(qiáng)的移動能力。但是在旋轉(zhuǎn)測試能力中并沒有顯著差異。因此,Drd2-Cre;Sp9Flox/Flox小鼠的快速移動能力增強(qiáng),但不影響焦慮和運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。
3. Sp9作用分子機(jī)制探究
已有報道顯示Ascl1與小鼠Dre2+MSNs的生成有關(guān)。研究人員用原位RNA雜交進(jìn)行了確認(rèn)。與對照相比,Ascl1GFP/GFP突變小鼠中在P0期Drd2表達(dá)顯著下降。在E14.5和E16.5期,Ascl1GFP/GFP突變小鼠背側(cè)LGE SVE中的SP9蛋白與RNA表達(dá)都減少,暗示著Ascl1可以正向調(diào)控了Sp9的表達(dá)。
為進(jìn)一步驗(yàn)證其調(diào)控關(guān)系,研究人員分析了Sp9的啟動子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)有Ascl1的保守結(jié)合位點(diǎn)(E-box sites, CAGCTG or CACCTG)。ChIP qPCR實(shí)驗(yàn)表明兩者確實(shí)能夠結(jié)合。
對P19期胎瘤細(xì)胞進(jìn)行雙熒光轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了Ascl1可以通過(CAGCTG)結(jié)合Sp9 E245激活Sp9的轉(zhuǎn)錄。因此,這些結(jié)果表明Ascl1通過直接結(jié)合到Sp9的啟動子區(qū)促進(jìn)LGE SVE中Sp9的表達(dá)。
研究結(jié)論
該研究通過表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子Sp9在LEG祖細(xì)胞中的廣泛表達(dá)。運(yùn)用Sp9-null突變小鼠,發(fā)現(xiàn)Sp9對于紋狀體蒼白球MSNs的增殖,凋亡密切相關(guān)。進(jìn)一步的ChIP qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Sp9受到上游Ascl1的調(diào)控。RNA-seq實(shí)驗(yàn)表明Sp9促進(jìn)了下游GPCRsa家族蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)生物學(xué)功能。該研究深入理解神經(jīng)節(jié)發(fā)育過程中紋狀體蒼白球MSNs的產(chǎn)生,分化和生存過程提供了新的證據(jù)。
原文出處: Zhang Q, Zhang Y, Wang C, et al. The Zinc Finger Transcription Factor Sp9 Is Required for the Development of Striatopallidal Projection Neurons. Cell Rep. 2016 ,16(5):1431-44.