足底電擊應(yīng)激時程對大鼠焦慮樣行為的影響

【摘要】 目的 觀察足底電擊應(yīng)激時程對大鼠高架十字迷宮及開場實驗焦慮樣行為的影響。方法 選取成年雄性 SD 大鼠按照體重分層隨機(jī)分為對照組和足底電擊組，每組 12 只。足底電擊組予以不可逃避性足底電擊( 0. 8 m A，電擊 10 s，休息 20 s，共 5 min，1 次/d) 結(jié)合孤養(yǎng)建立大鼠焦慮模型。分別在足底電擊 7 d 及 14 d 后測高架十字迷宮和開場實驗，評估大鼠的焦慮行為。結(jié)果 7 d 及 14 d 足底電擊后，足底電擊組焦慮樣行為增加，差異具有顯著意義( P ＜ 0. 01) ，入臂總次數(shù)明顯低于對照組，運(yùn)動活性降低。開場實驗足底電擊組進(jìn)入中心區(qū)次數(shù)及中心區(qū)逗留時間低于對照組( P ＜ 0. 01) ，運(yùn)動總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù)足底電擊組均明顯低于對照組( P ＜0. 01) ，運(yùn)動探索活性降低。比較 7 天及 14 天足底電擊組行為學(xué)結(jié)果，可見隨著造模天數(shù)的增加，大鼠閉臂時間比及閉臂次數(shù)比呈現(xiàn)下降趨勢( P ＜ 0. 05) ，焦慮程度降低。開場實驗運(yùn)動總距離、直立次數(shù)及理毛次數(shù) 14 d 低于 7d，差異具有顯著性( P ＜ 0. 05) ，提示大鼠運(yùn)動探索行為進(jìn)一步減少，自我關(guān)注度降低，抑郁樣行為增加。結(jié)論 不同時程的足底電擊應(yīng)激導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為，影響大鼠運(yùn)動探索活性。隨著造模天數(shù)的增加，大鼠行為可能從焦慮樣向抑郁樣改變。足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時程的選擇 7 d 優(yōu)于 14 d。

【關(guān)鍵詞】 焦慮; 動物模型; 足底電擊; 行為學(xué)

焦慮障礙在現(xiàn)今社會非常普遍，病程緩慢，與眾多負(fù)面結(jié)果相關(guān)，如自殺風(fēng)險更大，合并內(nèi)科病，并且當(dāng)與抑郁共病緩解率低。焦慮障礙的研究需要動物模型的支持。雖然嚙齒類動物焦慮樣行為與人類臨床焦慮定義有所區(qū)別，二者相似的受累腦區(qū)，以及人類抗焦慮藥物對嚙齒類動物行為學(xué)的改善，說明嚙齒類動物焦慮樣行為的研究可以對人類的焦慮問題研究提供線索。

應(yīng)激在神經(jīng)變性疾病和精神疾病相關(guān)的眾多病理生理過程中扮演重要角色。過度的應(yīng)激反應(yīng)與焦慮相關(guān)。已有研究顯示短期的慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠焦慮樣行為。足底電擊應(yīng)激是經(jīng)典應(yīng)激方式的一種，廣泛地應(yīng)用于條件恐懼相關(guān)研究。

焦慮與恐懼關(guān)系密切，已有不少研究采用不可避免足底電擊應(yīng)激制造焦慮抑郁動物模型。但目前缺少不同時程的足底電擊應(yīng)激對大鼠焦慮樣行為影響的研究。我們將成年 SD 大鼠足底電擊不同時程后，觀察不同程度的慢性應(yīng)激刺激對大鼠高架十字迷宮及開場實驗所示焦慮樣行為的影響，目的是尋找到足底電擊焦慮模型的最佳造模時間節(jié)點(diǎn)，為研究典型焦慮樣行為提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1. 1 材料

1. 1. 1 動物及分組

SPF 級 SD 雄性大鼠 24 只，體重為 200 ～ 220 g，6周齡，由上海實驗動物資源中心( 西普爾-必凱) 提供【SCXK( 滬) 2013 －0016】。動物飼養(yǎng)在大鼠通風(fēng)鼠籠中，環(huán)境溫度控制在 21 ～ 23℃，濕度為 50% 左右，食水自由。實驗于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗 動 物 中 心【SYXK( 蘇) 2014 －0001】內(nèi)進(jìn)行。實驗過程中對動物的處置嚴(yán)格遵守我國科技部 2006 年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。動物適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，按體重分層隨機(jī)分為對照組( control group，12 只) 、足底電擊組( footshock group，F(xiàn)S，12 只) 。

1. 1. 2 儀器與設(shè)備

實驗器材: 足底電擊箱( SLY-SRC 刺激記錄控制器，北京碩林苑科技有限公司) ; 大鼠通風(fēng)鼠籠( EVC，蘇州猴皇動物實驗設(shè)備科技有限公司) ; 動物行為錄像及分析采用SuperMaze動物行為視頻分析系統(tǒng)( XR-Xmaze，上海欣軟信息科技有限公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 實驗方案

為避免大鼠間氣息交流影響情緒狀態(tài)，本實驗足底電擊組均采用孤養(yǎng)，大鼠通風(fēng)鼠籠設(shè)備可避免大鼠間氣息交流。對照組群養(yǎng)，每日撫摸數(shù)分鐘，余不作任何處理。足底電擊組每日接受一次足底電擊，電擊參數(shù): 0. 8 m A，電擊 10 s，休息 20 s，共 5min。在足底電擊 7 d 及 14 d 后測高架十字實驗( 10: 00 ～ 12: 30) 、開場實驗( 14: 00 ～ 15: 00) ，評估大鼠的焦慮行為。

1. 2. 2 高架迷宮實驗

高架十字迷宮(XR-XG201) 裝置(SuperMaze動物行為視頻分析系統(tǒng)XR-Xmaze，上海欣軟信息科技有限公司) 由兩條相對開放臂( 50 cm × l0 cm) 和兩條相對閉合臂( 50 cm × l0 cm ×40 cm) 及中央?yún)^(qū)( 10 cm× l0 cm) 連接而成，距離地面 50 cm。實驗前將大鼠搬至實驗室適應(yīng)環(huán)境 1 h 以上，保持室內(nèi)安靜，暗光。實驗開始時將大鼠從中央格面向閉合臂放入迷宮，記錄 5 min 內(nèi)的活動情況。觀察大鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)及停留時間。每只大鼠實驗結(jié)束后取出，將各臂清理干凈，并用 75% 的酒精去除氣味。行為學(xué)結(jié)果(1) 閉臂時間比 = 閉臂時間/( 開臂時間 + 閉臂時間) ; (2) 閉臂次數(shù)比 = 閉臂次數(shù)/( 開臂次數(shù) + 閉臂次數(shù)) 。(3) 入臂總次數(shù) = 閉臂次數(shù) + 開臂次數(shù)。行為學(xué)結(jié)果應(yīng)用 SPSS 軟件箱式圖法剔除離群值。

1. 2. 3 開場實驗

本實驗敞箱（由上海欣軟信息科技有限公司提供）長 × 寬 × 高為: 100 cm × 100 cm ×40 cm，內(nèi)面及底面均為灰色，中央?yún)^(qū)正上方安置攝像頭。實驗第 8 天及第 15 天時，每組大鼠分別進(jìn)行曠場實驗，實驗前把動物提前 1 h 搬進(jìn)測試室適應(yīng)環(huán)境，實驗開始后，將大鼠放到中央?yún)^(qū)固定位置，每次放置頭部固定朝向一側(cè)。每只大鼠測量 5 min，測量指標(biāo)包括運(yùn)動總距離、中央?yún)^(qū)停留時間、中央?yún)^(qū)進(jìn)入次數(shù)、直立次數(shù)及理毛次數(shù)，隨后用 75% 酒精清潔箱內(nèi)環(huán)境，等酒精揮發(fā)無味后，再進(jìn)行下 1 只。

1. 3 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，采用獨(dú)立樣本 t 檢驗進(jìn)行組間比較，P ＜ 0. 05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

關(guān)于如何建立起較為合理的焦慮動物模型，目前應(yīng)用的造模方法有很多種，包括: 高架十字迷宮、空瓶刺激、天敵暴露、飲水沖突等等，但是仍然存在很多不確定因素和干擾因素。應(yīng)激是精神疾病的重要基礎(chǔ)，與焦慮抑郁密切相關(guān)，慢性應(yīng)激焦慮模型可作為焦慮模型的一種。

應(yīng)激的不同時程影響動物行為，急性應(yīng)激時，動物的活動增加，但是隨應(yīng)激時間的延長，動物的行為活動逐漸減少，表現(xiàn)為由興奮焦慮狀態(tài)過渡到壓抑抑郁狀態(tài)。應(yīng)激發(fā)生的不同時期( 新生期或成熟期) 以及不同時程對腦結(jié)構(gòu)功能、行為、認(rèn)知產(chǎn)生不同的效應(yīng)，這種影響與應(yīng)激所致機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌改變相關(guān)。分別于強(qiáng)迫游泳應(yīng)激第 1，3，7，14 和 28 天觀察應(yīng)激對大鼠海馬谷氨酸、天冬氨酸及 γ-氨基丁酸( gamma-aminobutyric acid，GABA) 含量的影響，結(jié)果顯示第 3 天開始海馬興奮性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸含量持續(xù)增高，興奮性氨基酸拮抗劑 GABA 含量在急性應(yīng)激時降低，于 14 d 后開始增高。金玉祥等的研究發(fā)現(xiàn)在不同足底電擊應(yīng)激 時 程，大 鼠 腦 內(nèi) 一 氧 化 氮 合 酶 ( nitric oxidesynthase，NOS) 表達(dá)呈現(xiàn)動態(tài)變化: 應(yīng)激早期( 1 ～ 6d) NOS 陽性神經(jīng)元的核團(tuán)數(shù)目增多，NOS 活性增加; 隨著應(yīng)激時程延長，陽性核團(tuán)數(shù)目逐漸減少，15d 時眾多腦區(qū)的 NOS 表達(dá)較前明顯下降�；�于以上，慢性應(yīng)激焦慮模型需要把握應(yīng)激時程。焦慮與抑郁往往伴發(fā)出現(xiàn)，焦慮反應(yīng)和抑郁反應(yīng)之間可能僅僅存在一個時間跨度，短期的刺激可以導(dǎo)致焦慮，而在 此 基 礎(chǔ) 上 的 延 長 刺 激 則 可 導(dǎo) 致 抑 郁 發(fā)生。比較大鼠 7 d、14 d 以及 21 d 行為學(xué)表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn) 14 d 慢性束縛應(yīng)激大鼠主要表現(xiàn)為焦慮狀態(tài)，而21 d 大鼠則主要以抑郁為主。綜合之前的各項研究，我們選擇 7 d 及 14 d 這兩個時間節(jié)點(diǎn)觀察足底電擊應(yīng)激時程對大鼠焦慮樣行為的影響。

本實驗采用高架十字迷宮及開場實驗評價足底電擊應(yīng)激所致大鼠焦慮樣行為，基于引起焦慮因素，例如未受保護(hù)的、升高的區(qū)域或一個開放區(qū)域，焦慮水平被表達(dá)為進(jìn)入?yún)拹簠^(qū)域的次數(shù)及逗留時間。除此以外，高架十字迷宮的入臂總次數(shù)，開場的運(yùn)動總距離及直立次數(shù)可以表征大鼠運(yùn)動活性及探索欲望，理毛次數(shù)反映大鼠對自己的關(guān)注度，大鼠運(yùn)動探索及自我關(guān)注的下降，一定程度上反映大鼠抑郁樣行為。已有研究表明間隔一周的兩次高架及開場實驗主要指標(biāo)在初測及復(fù)測實驗中均呈較好相關(guān)性及較好復(fù)測信度，可以認(rèn)為大鼠對高架十字迷宮及開場實驗的適應(yīng)和記憶效應(yīng)并未太大影響實驗結(jié)果。本研究足底電擊組在高架十字迷宮及開場實驗中均顯示出對開放區(qū)域的回避，表現(xiàn)為閉臂停留時間及進(jìn)入次數(shù)的增多，開場中心區(qū)探索時間及進(jìn)入次數(shù)的減少，焦慮樣行為顯著。與此同時，入臂總次數(shù)、開場運(yùn)動總距離、直立及自我修飾次數(shù)較對照組也顯著降低，顯示明顯抑郁樣行為。比較不同造模時間，我們還觀察到隨著足底電擊應(yīng)激時程的增加，大鼠焦慮樣行為減輕，抑郁程度加重。

綜上所述，足底電擊結(jié)合孤養(yǎng)可致大鼠焦慮樣行為，可作為慢性應(yīng)激焦慮模型的一種。14 d 大鼠的焦慮程度較 7 d 有所下降，然而大鼠運(yùn)動探索活性及自我關(guān)注度進(jìn)一步降低，抑郁樣行為增加。可以認(rèn)為足底電擊應(yīng)激焦慮模型造模時程的選擇，7 d較 14 d 更優(yōu)。我們的實驗結(jié)果從行為學(xué)角度進(jìn)一步支持應(yīng)激時程影響動物焦慮抑郁樣行為的觀點(diǎn)，研究應(yīng)激相關(guān)精神疾病應(yīng)重視應(yīng)激的時程、強(qiáng)度以及應(yīng)激類型的差別，這與臨床實際情況更加接近，并且時程影響背后的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。