高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)相關(guān)文獻(xiàn)-高壓氧對大鼠行為學(xué)及應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)影響的研究

【摘要】 目的通過對大鼠行為學(xué)及應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的觀察，探討高壓氧與應(yīng)激的關(guān)系。方法20只Wistar大鼠按照數(shù)字表法隨機(jī)分為高壓氧組和空白對照組，高壓氧組給予0．20 MPa高壓氧處理，連續(xù)治療3周；對照組單純喂養(yǎng)，分別在第l、7、14、21天對其進(jìn)行高架十字迷宮試驗(yàn)，觀察大鼠開臂逗留時間，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法測定其血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、一氧化氮合酶、一氧化氮及腫瘤壞死因子．a(chǎn)(TNF．d)含量。結(jié)果高壓氧處理可明顯增加大鼠外周血液中糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCS)的水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，但對大鼠高架十字迷宮中的開臂逗留時間、一氧化氮系統(tǒng)及TNF．0【的表達(dá)無明顯影響(P>0．05)。結(jié)論高壓氧處理符合慢性應(yīng)激的一般特征，但又不對機(jī)體造成明顯的不良影響，提示高壓氧的作用機(jī)制之一是作為一種良性應(yīng)激來增加機(jī)體對應(yīng)激的耐受能力。

【關(guān)鍵詞】高壓氧；高架十字迷宮；HPA軸；一氧化氮系統(tǒng)；腫瘤壞死因子一Ot；大鼠

高壓氧治療在臨床應(yīng)用十分廣泛，涉及臨床諸多學(xué)科，腦外傷后恢復(fù)期、突發(fā)性耳聾、脊髓損傷及糖尿病足等疾病的治療，其治療過程中壓力及呼吸氧氣濃度的變化對于機(jī)體來說屬于一種應(yīng)激事件，因此長時間連續(xù)的高壓氧處理有可能成為慢性應(yīng)激源，所以了解高壓氧對機(jī)體的影響對臨床治療十分重要。為此筆者設(shè)計了本實(shí)驗(yàn)，通過對大鼠的行為學(xué)、下丘腦．垂體一腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸、血清中一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子等進(jìn)行觀察，以探索高壓氧對機(jī)體應(yīng)激的影響。

材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動物與處理：8周齡雄性Wistar大鼠20只，體質(zhì)量200—250 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。熟悉環(huán)境7 d，按數(shù)字表法隨機(jī)平均分成2組：單純高壓氧組及空白對照組。單純高壓氧組：每天上午9：00—10：00，0．20 MPa，100％氧濃度，升壓時間10 min，穩(wěn)壓60 min，減壓時間15 min，連續(xù)治療21 d；空白對照組：單純飼養(yǎng)21 d。實(shí)驗(yàn)動物自由進(jìn)食飲水，每天12 h光照。

2．高架十字迷宮試驗(yàn)：高架十字迷宮(由上海欣軟信息科技有限公司提供）：高35 cm，2個開臂(open arm，OA)及2個閉合臂寬10 cm長50 em，閉合臂壁高25 cm，內(nèi)側(cè)及底部涂黑，高架十字迷宮上方約1 m處設(shè)有照明用500 W燈及攝像頭。實(shí)驗(yàn)過程：每次試驗(yàn)前轉(zhuǎn)移動物至高架十字試驗(yàn)室，熟悉環(huán)境10 min，實(shí)驗(yàn)動物背向操作人員置于高架十字迷宮中心，面向開臂，記錄大鼠5 min的活動…。下次試驗(yàn)前用清水消除實(shí)驗(yàn)動物氣味。高壓氧組及空白對照組動物在熟悉環(huán)境1周后，分別于第1天、第7天、第14天及第21天作高架十字迷宮試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以開臂逗留時間及開臂穿越數(shù)作統(tǒng)計。

3．麻醉及取材：實(shí)驗(yàn)動物在完成高架十字迷宮試驗(yàn)后，單純飼養(yǎng)1 d，于上午9：00—12：00期間給予20％烏拉坦0．7 ml／100 g腹腔注射麻醉，肌肉完全松弛及角膜反射存在為麻醉成功標(biāo)志。開腹，暴露腹主動脈，10 ml注射器取血，促凝管搖勻，以1 000 r／min離心10 min，離心半徑r=15 cm，取上清液，一20℃保存。

4．血清標(biāo)本指標(biāo)的測定：通過酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme．1inked immuno sorbent assay，ELISA)測定血清中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocor ticotropic hormore，ATCH)、糖皮質(zhì)激素(glueocorticoids，GCS)、一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)及腫瘤壞死因子一o【(tumor necrosis factor，TNF-d)含量，試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，使用MULTISKAN EX酶標(biāo)儀檢測。

5．統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。原始數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(元±s)表示，利用重復(fù)測量觀察組間及組內(nèi)是否存在差異。排除性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為僅=0．05，納人性檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)為d=0．1。P<0．05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

慢性應(yīng)激的致病過程是復(fù)雜的，有研究認(rèn)為其致病過程主要由GCS抵抗舊J、HPA軸負(fù)反饋障介導(dǎo)，而外周循環(huán)中促炎癥因子及外周GCS的增加作為其終末效應(yīng)很有可能是慢性應(yīng)激的最終致病途徑，其中炎癥因子的增加可以促使NOS及NO表達(dá)的下降Hj，并有可能誘發(fā)動脈粥樣硬化的出現(xiàn)。

循環(huán)炎癥因子增加最突出的表現(xiàn)就是病態(tài)行為，如探索欲下降、攝食及運(yùn)動減少，困倦以及認(rèn)知功能的下降。所以本實(shí)驗(yàn)首先通過觀察大鼠焦慮行為的變化，初步評價高壓氧導(dǎo)致大鼠當(dāng)次應(yīng)激的程度。高架十字迷宮首先由File等于1985進(jìn)行描述，主要通過觀察實(shí)驗(yàn)動物開放臂及閉合臂逗留時間評估實(shí)驗(yàn)動物對外界的探索欲望，從而對其焦慮程度進(jìn)行評估，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其對焦慮程度的評價相對于曠場試驗(yàn)要直接與準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)可以看出，高壓氧組大鼠的焦慮程度與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示高壓氧處理在3周內(nèi)可能并不會增加實(shí)驗(yàn)動物的焦慮程度。除此之外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)第2周后高壓氧組大鼠的開臂逗留時間開始減少，其原因可能為應(yīng)激時間的長短所導(dǎo)致的，如同樣的慢性束縛應(yīng)激，不同的束縛時間導(dǎo)致了曠場試驗(yàn)結(jié)果的差異，高壓氧也是如此，高壓氧處理時間不一，其行為學(xué)表現(xiàn)也可能不同。提示高壓氧治療在應(yīng)激損傷方面可能存在一個累積的效應(yīng)。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果出發(fā)，筆者推測高壓氧治療的療程應(yīng)維持在2—3周內(nèi)，但是上述推論仍需通過進(jìn)一步延長實(shí)驗(yàn)時間及增加樣本量來明確。

HPA軸負(fù)反饋障礙作為應(yīng)激致病的核心，主要表現(xiàn)為應(yīng)激過程中HPA軸持續(xù)興奮，即循環(huán)CRH、ATCH及GCS的增加。在慢性應(yīng)激人群如抑郁癥患者¨¨及慢性應(yīng)激的動物模型¨糾中均可觀察到這一現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)觀察到接受連續(xù)高壓氧處理的大鼠其HPA軸上游的CRH及ATCH并無差別，但是其GCS水平明顯提高，提示高壓氧處理雖然出現(xiàn)了糖皮質(zhì)激素的上升，但與一般的慢性應(yīng)激不同。而這種HPA軸上游激素變化與GCS變化的不對稱，說明了此時下丘腦一垂體段HPA軸負(fù)反饋通路是正常的。本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的這種現(xiàn)象考慮與應(yīng)激強(qiáng)度有關(guān)。在f臨床研究中可發(fā)現(xiàn)處于慢性應(yīng)激狀態(tài)中個體的ACTH及CRH mRNA表達(dá)下降，但血清GCS的水平卻持續(xù)升高，如Cotella等¨引對母愛剝奪人群的研究。另外慢性束縛應(yīng)激，這類輕微的應(yīng)激源同樣可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)大鼠外周持續(xù)高水平的GCS但并不表現(xiàn)出CRH及ACTH的上升¨引。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測HPA軸負(fù)反饋功能的異�？赡軆H存在于強(qiáng)度高持續(xù)時間長的應(yīng)激事件之中。而高壓氧可能屬于一種輕微的應(yīng)激，并不會對HPA軸的反饋功能造成損害。另外高壓氧雖然其HPA軸負(fù)反饋功能保持正常，但是GCS的水平還是表現(xiàn)出明顯的上升，推測其原因可能出現(xiàn)在腎上腺皮質(zhì)上。有實(shí)驗(yàn)證明慢性應(yīng)激并不會導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)對ACTH的敏感性增加，提示GCS的水平持續(xù)升高則可能與其他因素相關(guān)，如腎上腺皮質(zhì)的增生及肥大，導(dǎo)致其對ACTH刺激所分泌的GCS的量的增多¨6|。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，對大鼠的解剖也發(fā)現(xiàn)了高壓氧處理組腎上腺的體積明顯大于空白對照組，但是本實(shí)驗(yàn)并沒有繼
續(xù)就此推論繼續(xù)對腎上腺進(jìn)行稱質(zhì)量及病理學(xué)觀察，此為本實(shí)驗(yàn)一個不足之處。

一氧化氮系統(tǒng)特別是血管一氧化氮系統(tǒng)受損在機(jī)體主要表現(xiàn)為內(nèi)皮介導(dǎo)的血管舒張障礙，使得血管在血壓變化時的自我調(diào)節(jié)能力降低，間接促進(jìn)了內(nèi)皮損傷的出現(xiàn)。內(nèi)皮損傷結(jié)合多種因素最終導(dǎo)致了動脈粥樣硬化的形成¨7|。循環(huán)炎癥因子的增加作為慢性應(yīng)激致病的直接途徑之一，表現(xiàn)為循環(huán)IL一1、IL-6、TNF—d等的增加，此類炎癥因子的增加可使緩激肽介導(dǎo)的血管舒張發(fā)生障礙、血管一氧化氮合酶(eNOS)的mRNA表達(dá)及蛋白含量下降，最終使H：O：表達(dá)上升，介導(dǎo)氧化應(yīng)激¨8|。所以慢性應(yīng)激對一氧化氮系統(tǒng)的影響主要來自于促炎因子的作用。故本實(shí)驗(yàn)嘗試?yán)�用對一氧化氮系統(tǒng)及促炎癥因子TNF．Ot的觀察，評價高壓氧治療中出現(xiàn)的應(yīng)激損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)觀察到高壓氧雖然是一種應(yīng)激源。但是與空白組相比NOS及NO的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示高壓氧處理可能并不會對大鼠的內(nèi)皮NO系統(tǒng)產(chǎn)生影響。另外高壓氧組中作為慢性應(yīng)激致病原因之一的TNF一僅較空白組的低，雖無統(tǒng)計學(xué)意義但存在明顯趨勢，提示高壓氧或能降低循環(huán)促炎癥因子的合成。其中作為與交感神經(jīng)拮抗的副交感神經(jīng)被認(rèn)為與交感介導(dǎo)的能量分布及系統(tǒng)炎癥反應(yīng)相拮抗，而為保證獲得性免疫的強(qiáng)度，在炎癥過程中其活性常被抑制019]，同時高壓氧治療中一個特點(diǎn)就是副交感神經(jīng)的興奮性增加，所以本實(shí)驗(yàn)推測TNF—a的降低可能通過副交感神經(jīng)的興奮，利用其抗炎作用，促使循環(huán)促炎因子下降，但上述推論仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從應(yīng)激的角度出發(fā)，觀察到連續(xù)高壓氧處理具備了慢性應(yīng)激的一般特征，如循環(huán)GCS的提高；但另一方面其又不像一般慢性應(yīng)激那樣能明顯增加機(jī)體的焦慮程度，同時還或許能夠通過提高副交感的活性抑制炎癥因子的產(chǎn)生、降低TNF．0【甚至其他促炎癥因子的表達(dá)來使機(jī)體抵抗其他應(yīng)激源造成的損害。

適當(dāng)?shù)膽?yīng)激能夠加強(qiáng)機(jī)體對外界應(yīng)激的抵抗能力，Ostrander等㈣1發(fā)現(xiàn)處于慢性應(yīng)激恢復(fù)期的大鼠在接受新類型的刺激后表現(xiàn)出GCS、ACTH水平及室旁核CRH mRNA的下降。說明了大鼠對應(yīng)激是有適應(yīng)性的，故能否達(dá)到有效的適應(yīng)能力，而且在此之間并未對機(jī)體發(fā)生損傷可能就是良性應(yīng)激的界定標(biāo)準(zhǔn)。而本實(shí)驗(yàn)所初步觀察到的結(jié)果提示，連續(xù)的高壓氧治療對機(jī)體來說具備了作為良性應(yīng)激的前提，即可能對機(jī)體沒有造成過多的損傷甚至能降低其他應(yīng)激源的損害，但是否能作為良性應(yīng)激被利用還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。