1.sanger

企業(yè)：Life Technology

推出時(shí)間：1977年發(fā)明，1986年第一臺(tái)商業(yè)化測(cè)序儀

主流型號(hào)：3730XL

樣品要求：PCR產(chǎn)物：濃度≥50ng/ul 體積≥10ul；質(zhì)粒：含量≥5ug；菌液：體積≥1ml。

測(cè)序原理:

雙脫氧鏈終止法：Sanger法測(cè)序的原理就是，每個(gè)反應(yīng)含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之?dāng)U增，并混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)使之終止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3‘-OH基團(tuán)，使延長(zhǎng)的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止，終止點(diǎn)由反應(yīng)中相應(yīng)的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對(duì)濃度可以調(diào)整，使反應(yīng)得到一組長(zhǎng)幾個(gè)至千以上個(gè)，相差一個(gè)堿基一系列片斷。它們具有共同的起始點(diǎn)，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高分辨率變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理后可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)。

文庫(kù)制備:無需建庫(kù)，提供質(zhì)粒、菌液、PCR產(chǎn)物等均可以

模板制備:PCR擴(kuò)增

讀長(zhǎng):500-1000bp

測(cè)序通量:

四種測(cè)序方式的每天通量：

短片段測(cè)序36cm36min500bp 1,728,000bp/day；

快速測(cè)序36cm60min700bp 1,440,000bp/day；

標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序36cm90min800bp 1,113,000bp/day；

長(zhǎng)片段測(cè)序50cm120min1100bp 1,002,000bp/day。

(36cm指毛細(xì)管長(zhǎng)度，36min指一次反應(yīng)時(shí)間，500bp指一個(gè)反應(yīng)的讀長(zhǎng)；)

時(shí)間/run:36 min-2 hours

堿基精確度:99.999%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面):

heterozygous insertions and deletions,microsatellite, SNP, AFLP, T-RFLP,and LOH analyses

AFLP：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism),；

T-RFLP：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism）；

LOH analyses：雜合性缺失（Loss of Heterozygosity）；

成本:$95,000 per machine, about $4 per reaction, 800bp per reaction,

數(shù)據(jù)格式:*.bcf ； *.abl

分析軟件:

數(shù)據(jù)收集軟件Data Collection v2.0 (隨機(jī)提供)

Manages your instrument setup, controls instrument operations, allows real-time data visualization, and performs diagnostics. New features include:

- Auto-analysis with GeneMapper® v3.5 and SeqScape® v2.1

- FDA 21CFRpart 11 compliance (for US customers)

- Flexibility to use any choice in dye set option

- Additional optimized sequencing run modules covering more applications

序列分析軟件Sequencing Analysis v5.1

Designed to base-call; assign quality values; trim, display, edit and print DNA sequencing data using the KB basecaller

序列拼接和比較基因分析軟件Seqscape® v2.1

Provides everything you need to perform resequencing applications such as VariantSEQr™ Resequencing System

自動(dòng)化基因片段分析軟件GeneMapper® v3.5

Enables configurable, automated allele calling -- a plus for high-throughput genotyping and includes tools for SNPlex™ data analysis

SNP分型數(shù)據(jù)管理軟件BioTrekker™ v1.0 (optional data-mining tool)

Provides a fast, powerful way to search for, retrieve, and manage millions of genotypes

優(yōu)點(diǎn):測(cè)序金標(biāo)準(zhǔn)，讀長(zhǎng)長(zhǎng)

缺點(diǎn):通量低，成本高

經(jīng)典案例:Sanger測(cè)序?qū)儆跍y(cè)序技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，文章眾多

備注:鑒于測(cè)序本身方法的局限，測(cè)序引物后10bp～40bp無法保證準(zhǔn)確

2.454

企業(yè): Roche

推出時(shí)間: 2005年

主流型號(hào): Genome Sequencer FLX Titanium（2008年推出）

樣品要求: 5 μg of DNA，濃度≥300 ng/μL

測(cè)序原理：焦磷酸測(cè)序

在測(cè)序時(shí)，使用了一種叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有160多萬個(gè)由光纖組成的孔，孔中載有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所需的各種酶和底物。測(cè)序開始時(shí)，放置在四個(gè)單獨(dú)的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進(jìn)入PTP板，每次只進(jìn)入一個(gè)堿基。如果發(fā)生堿基配對(duì)，就會(huì)釋放一個(gè)焦磷酸。這個(gè)焦磷酸在各種酶的作用下，經(jīng)過一個(gè)合成反應(yīng)和一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時(shí)釋放出光信號(hào)。此反應(yīng)釋放出的光信號(hào)實(shí)時(shí)被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個(gè)堿基和測(cè)序模板進(jìn)行配對(duì)，就會(huì)捕獲到一分子的光信號(hào)；由此一一對(duì)應(yīng)，就可以準(zhǔn)確、快速地確定待測(cè)模板的堿基序列。

文庫(kù)制備：Fragment(300-800 bp), Mate-pair

模板制備：微乳液PCR

讀長(zhǎng)：400bp

測(cè)序通量：0.4-0.6 Gb/run

時(shí)間/run：10 hours

堿基精確度：Q20讀長(zhǎng)為400個(gè)堿基

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面：SNP, Indel, SV, CNV

成本：儀器$500,000/臺(tái)，測(cè)序$5,600 per whole plate

數(shù)據(jù)格式：Raw data：SFF格式

分析軟件：GS De Novo Assembler軟件；GS Reference Mapper軟件；GS Amplicon Variant Analyzer軟件

優(yōu)點(diǎn)：突出優(yōu)勢(shì)是讀長(zhǎng)長(zhǎng)，使得后繼的序列拼接工作更加高效、準(zhǔn)確。速度快，一個(gè)測(cè)序反應(yīng)耗時(shí)10個(gè)小時(shí)，獲得4-6億個(gè)堿基對(duì)。

缺點(diǎn)：無法準(zhǔn)確測(cè)量同聚物的長(zhǎng)度，所以檢測(cè)插入缺失突變的誤差率高；通量小且費(fèi)用高。

經(jīng)典案例：1.Complete Khoisan and Bantu genomes from southern Africa.Schuster SC et al. (2010) Nature 463(7283): 943-7.

(更多詳見https://www.roche-applied-scienc ... ng/genome/index.jsp)

備注：特別適合從頭拼接和宏基因組學(xué)應(yīng)用，多用于新的細(xì)菌基因組。對(duì)重測(cè)序來說太貴，不適合

3.Solid

企業(yè): Life Technology(2008年，ABI與Invitrogen合并為L(zhǎng)ife Technology公司)

推出時(shí)間: 2007年

主流型號(hào): Solid™4.0（2010年推出）

樣品要求:

• Fragment文庫(kù)10 ng-5 μg

•Paired-end文庫(kù)10 ng-5 μg

•Mate-paired文庫(kù)5 μg-20 μg

測(cè)序原理: 邊連接邊測(cè)序

測(cè)序引物與接頭可以互補(bǔ)雜交，其5‘端可與和鄰近序列互補(bǔ)的寡核苷酸相連。八聚體寡核苷酸可競(jìng)爭(zhēng)性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標(biāo)記位點(diǎn)）。當(dāng)其標(biāo)記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標(biāo)記，進(jìn)行下一輪反應(yīng)，以此依次循環(huán)。在第一輪反應(yīng)中，可以得到確定的堿基位點(diǎn)為：4、5、9、10、14、15位堿基等。重復(fù)該反應(yīng)過程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個(gè)堿基的引物進(jìn)行反應(yīng)，可以確定的堿基位點(diǎn)包括：3、4、8、9、13、14等，如此往復(fù)，直至偏移至引物的第一個(gè)堿基（即待測(cè)序列0位點(diǎn)堿基）。由于該位點(diǎn)堿基已知，可通過讀取的熒光顏色得知位點(diǎn)1的堿基類型，然后，又以位點(diǎn)1堿基熒光顏色推知位點(diǎn)2的堿基類型，依此類推，直至整個(gè)序列讀序完成。

文庫(kù)制備:

• Mate-paired 文庫(kù) (插入片段 600 bp to 10 Kb)

• Paired-end 文庫(kù)

• Fragment 文庫(kù)

模板制備: 微乳液PCR

讀長(zhǎng): 2*50 bp

測(cè)序通量: 100-120 Gb/run, 12G/day

時(shí)間/run: 7~12 days

堿基精確度: 原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋深度時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP, Indel, SV, CNV

成本: 儀器$495,000/臺(tái)，測(cè)序$6000/100Gb

數(shù)據(jù)格式: Raw data: *csfasta和*quel；比對(duì)輸出格式：BAM/SAM。

分析軟件: 分析軟件：Bioscope,比對(duì)后格式有很多第三方軟件支持

優(yōu)點(diǎn): 高準(zhǔn)確性，每個(gè)DNA堿基檢測(cè)2次，增加了序列讀取的準(zhǔn)確性

缺點(diǎn): 運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)堿基替換突變的誤差率高

經(jīng)典案例: SOLiD測(cè)序技術(shù)僅在DNA應(yīng)用發(fā)表的文章共60篇，包括發(fā)表在Science/Nature及其子刊上的高水平文章15篇，其中de nove sequencing文章3篇，targeted resequencing文章26篇，whole genome resequencing文章31篇。SOLID在RNA和表觀等文章應(yīng)用也同樣廣泛。

備注: 行業(yè)領(lǐng)先的準(zhǔn)確性實(shí)現(xiàn)了重要的生物變異檢測(cè)，適合全基因組重測(cè)序、定向重測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組分析等應(yīng)用。

4.HiSeq2000

企業(yè): Illumina

推出時(shí)間: 2010/1/1

主流型號(hào): Illumina HiSeq2000

樣品要求: 6ug/sample,無RNA、蛋白污染，無降解，OD260/OD280=1.8-2.0

測(cè)序原理: 邊合成邊測(cè)序

這種測(cè)序技術(shù)通過將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面，這些DNA片斷通過延長(zhǎng)和橋梁擴(kuò)增，形成了具有數(shù)以億計(jì)cluster的Flowcell，每個(gè)cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。這種新方法確保了高精確度和真實(shí)的一個(gè)堿基接一個(gè)堿基的測(cè)序，排除了序列方面的特殊錯(cuò)誤，能夠測(cè)序同聚物和重復(fù)序列。This technology attach random fragment of genome DNA to optically transparent surface.And by extention bridge amplification of the DNA fragments,it create a flow cell with > 10 million clusters, each containing ~1,000 copies of same template. Then sequence by synthese using four kind of terminal-closed base with different fluorescent mark. This technology assures the high accuracy and one by one base sequencing, avoids special mistakes of sequence and can be applied for repeated sequence and homopolymer.

文庫(kù)制備: Fragment, Mate-pair (200bp-40kb)

模板制備: 橋式擴(kuò)增

讀長(zhǎng): 50SE,91PE,101PE 等

測(cè)序通量: 25G/day

時(shí)間/run:

91/101PE, 8-10 days ;

50SE, 3 days;

150PE, 15 days;

總體來說，策略不同，時(shí)間也有差別

堿基精確度: Q30%≥80%；Q20%≥90%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP、Indel、SV、CNV

成本: $690,000 per machine , $6000 per human genome sequencing(30X)

數(shù)據(jù)格式: 測(cè)序結(jié)果：*.fq;比對(duì)：*。SOAP/*.BAM/*.SAM;變異：*.gff

分析軟件: GenomeStudio或者第三方軟件包；自主選擇

優(yōu)點(diǎn): 通量大，測(cè)序方式靈活，分析軟件多樣化

缺點(diǎn): 在成本上目前高于第三代測(cè)序，樣本制備過程復(fù)雜，樣本要求相對(duì) 較高。

經(jīng)典案例: Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma.Chapman MA,et al.Nature. 2011 Mar 24;471(7339):467-72.

Cytoplasmic intron sequence-retaining transcripts can be dendritically targeted via ID element retrotransposons.Buckley PT,et al.Neuron. 2011 Mar 10;69(5):877-84.

Identification of fusion genes in breast cancer by paired-end RNA-sequencing.Edgren H,et al. Genome Biol. 2011 Jan 19;12(1):R6.

Genome-wide association mapping to candidate polymorphism resolution in the unsequenced barley genome.Cockram J,et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Dec 14;107(50):21611-6. Epub 2010 Nov 29.

MHC class II transactivator CIITA is a recurrent gene fusion partner in lymphoid cancers.Steidl C, et al.Nature. 2011 Mar 17;471(7338):377-81. Epub 2011 Mar 2.

Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.Navin N,et al.Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4. Epub 2011 Mar 13.

備注: 是目前市場(chǎng)上最主流的測(cè)序儀器，demo case眾多；另外，The additional benefit is experimental flexibility- applications that require different read lengths can be run on each flowcell – an example is that a whole genome sequencing and de novo sequencing study (eg. Of human and microorganism) could be run on one flowcell at 2 x 100bp reads, and the other could be running ChIP-seq and gene expression samples at 1 x 50bp read length. Each flowcell is controlled independently; hence, a run can be started/stopped independent of the other.

5.Helicos

企業(yè): Helicos Biosciences

推出時(shí)間: 2008年

主流型號(hào): HeliScope™ Single Molecule Sequencer（2008年推出）

樣品要求: 1-3 μg，起始DNA體積不超過100 μL.

測(cè)序原理: 邊合成邊測(cè)序,可逆阻斷測(cè)序

待測(cè)DNA被隨機(jī)打斷成小片段，在每個(gè)小片段（~200 bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上隨機(jī)固定多個(gè)poly-dT引物，其末端皆帶有熒光標(biāo)記，以利于精確定位。首先，將小片段DNA模板與檢測(cè)芯片上的poly-dT引物進(jìn)行雜交并精確定位，然后逐一加入熒光標(biāo)記的末端終止子。這個(gè)終止子與Illumina的終止子可不一樣，不是四色的，是單色的，也就是說所有終止子都標(biāo)有同一種染料。在摻入了單個(gè)熒光標(biāo)記的核苷酸后，洗滌，單色成像，之后切開熒光染料和抑制基團(tuán)，洗滌，加帽，允許下一個(gè)核苷酸的摻入。通過摻入、檢測(cè)和切除的反復(fù)循環(huán)，即可實(shí)時(shí)讀取大量序列。最后以軟件系統(tǒng)輔助，可分析出完整的核酸序列。

文庫(kù)制備: Fragment, Mate-pair

模板制備: 單分子檢測(cè)

讀長(zhǎng): 25-55 bp，平均35 bp

測(cè)序通量: 21 to 35 Gb/run

時(shí)間/run: 8 days

堿基精確度: >20X覆蓋度時(shí)一致性超過99.995%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP, CNV

成本: 儀器$999,000/臺(tái)，測(cè)序$0.45-0.60/Megabase.

數(shù)據(jù)格式: Raw data：srf或者sms格式

分析軟件: 推薦用Helisphere開放資源軟件進(jìn)行過濾比對(duì)

優(yōu)點(diǎn): 真正的單分子測(cè)序，無需前期擴(kuò)增，不引入偏向性;特別適合RNA-Seq或RNA直接測(cè)序的應(yīng)用，因?yàn)樗�能直接測(cè)序RNA模板，而無需將其轉(zhuǎn)化成cDNA。檢測(cè)堿基替換突變的誤差率非常低，~0.2%。

缺點(diǎn): 錯(cuò)誤率高，Insertion 1.5%，Deletion 3.0%；Heliscope在面對(duì)同聚物時(shí)也會(huì)遇到一些困難，但可以通過二次測(cè)序提高準(zhǔn)確度；由于在合成中可能摻有未標(biāo)記的堿基，因此其最主要的錯(cuò)誤來源是缺失。

經(jīng)典案例: 1.Single-molecule sequencing of an individual human genome.

Dmitry Pushkarev,Norma F Neff & Stephen R Quake.Nat Biotechnol, 27. (9): 847-852.

(更多詳見http://www.helicosbio.com/HeliSp ... id/169/Default.aspx)

備注: 特別適合RNA-Seq或RNA直接測(cè)序的應(yīng)用

6.DNA Nanoball array

企業(yè): Pacific Biosciences

推出時(shí)間: 2009年底Science論文發(fā)表,2010年推出

主流型號(hào): DNA Nanoball array

樣品要求: DNA 由

PicoGreen定量：推薦10ug，最少7.5ug。濃度:75-150ng/ul;體積：50-200ul;DNA長(zhǎng)度：大分子量雙鏈基因組DNA，大部分超過20kb.

測(cè)序原理: 邊連接邊測(cè)序

采用了高密度DNA（玻璃板）納米芯片技術(shù)和非連續(xù)、非連鎖聯(lián)合探針錨定連接（cPAL）技術(shù)來進(jìn)行測(cè)序�；�因組隨機(jī)打斷成500bp隨機(jī)長(zhǎng)度的片段，兩端接上接頭，成環(huán)，限制性內(nèi)切酶酶切，重復(fù)2次，最終連接成一個(gè)DNA環(huán)，現(xiàn)階段4接頭建庫(kù)方法能夠支持70bp單端測(cè)序（35bp雙端測(cè)序）。接著，所示，每個(gè)DNA環(huán)在反應(yīng)液中高速擴(kuò)增，形成一個(gè)納米球（DNB），這樣每一個(gè)DNA環(huán)大約擴(kuò)增了200次。然后把這些納米球平鋪到預(yù)先處理過的玻璃板上，形成納米芯片。最后通過非連鎖聯(lián)合探針錨定連接（cPAL）技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，10bp長(zhǎng)的探針上有一個(gè)錨定堿基（A or T or G or C），其他位置都是N，通過與模板的雜交連接反應(yīng)，根據(jù)4種不同的堿基（A/T/G/C）會(huì)有四種不同的熒光信號(hào)，總共需要40種不同的錨定探針。每一種錨定探針雜交之后都會(huì)進(jìn)行洗脫。通過DNB芯片的熒光顯影結(jié)果及解碼分析，我們可以確定每個(gè)DNB的核酸序列。

文庫(kù)制備: 500bp

模板制備: 納米球（DNB）

讀長(zhǎng): 35PE

測(cè)序通量: 20-60G/run/flow slide,共18 個(gè)flow slide

時(shí)間/run: 9 days

堿基精確度: 99.999%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP、Indel、SV、CNV

成本: 只提供測(cè)序服務(wù)，不出售儀器。09年11月的WGS成本為$1726 （45×），$8005 （87×）

數(shù)據(jù)格式: 基礎(chǔ)文本格式，*.tsv�？山桓督Y(jié)果包括：序列變異、功能注釋、數(shù)據(jù)總結(jié)報(bào)告 及一整套上述結(jié)果的支持?jǐn)?shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)由三部分組成，主要部分是reads和mappings，其次是assambly 和variations，summary report最少

分析軟件: Genome comparison tools、Format conversion tools、Annotation tools、Reference tools，在開發(fā)中的還有用于癌癥基因組分析的腫瘤-正常樣本比對(duì)工具和用于家族基因組分析的工具，還有大規(guī)模比對(duì)工具可以同時(shí)比對(duì)數(shù)百個(gè)基因組。Complete Genomics Assembly Pipeline version 1.5.0

優(yōu)點(diǎn): 測(cè)序自動(dòng)化，成本低，通量大

缺點(diǎn): 讀長(zhǎng)短，分析軟件不公開，樣品要求高

經(jīng)典案例: Identification by whole-genome resequencing of gene defect responsible for severe hypercholesterolemia. Jonathan Rios, et al. Human Molecular Genetics, Volume19, Issue22 Pp. 4313-4318.

Human Genome Sequencing Using Unchained Base Reads on Self-Assembling DNA Nanoarrays.Radoje Drmanac1,et al. Science, Vol. 327 no. 5961 pp. 78-81 .

Analysis of Genetic Inheritance in a Family Quartet by Whole-Genome Sequencing. Jared C. Roach,et al. Science, Vol. 328 no. 5978 pp. 636-639

The mutation spectrum revealed by paired genome sequences from a lung cancer patient.William Lee,et al.Nature ,Volume:465, Pages: 473–477

備注: mapping reads：40X/genome

7.The PacBio RS system

企業(yè): Pacific Biosciences

推出時(shí)間: 2010年2月開始早期試用

主流型號(hào): PacBio RS

樣品要求: 1kb以下500ng，純化的基因組 DNA, BACs, cDNA 文庫(kù) 或PCR 產(chǎn)物

測(cè)序原理: 邊合成邊測(cè)序，single molecule, real-time, or SMRT™, technology

這項(xiàng)技術(shù)的核心在于使用了Zero-Mode Waveguide(ZMW)(零波段邊界)。測(cè)序的平臺(tái)上有幾萬個(gè)小井，單個(gè)DNA聚合酶和要測(cè)序的DNA鏈固定在每一個(gè)小井里。帶有熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸(A,T,C,G)被加入到每個(gè)小井里。每一種脫氧核苷酸在激化后分別能放出不同波長(zhǎng)的熒光。小井的底部開了一個(gè)非常小的孔，小到比探測(cè)激光的單個(gè)波長(zhǎng)還要短。根據(jù)我們的常識(shí)，這個(gè)孔太小了，激光無法從井的底部穿過去，從而無法激發(fā)脫氧核苷酸上的熒光物質(zhì)。應(yīng)此，底部的顯微鏡檢測(cè)到的是一片黑暗。但是我們知道光線是一種波，它會(huì)衍射，激光雖然不能完全穿過小孔照亮整個(gè)小井，但它能透過小孔而勉強(qiáng)照亮小孔附近很小的一個(gè)區(qū)域。而DNA聚合酶正好被固定在這個(gè)小區(qū)域。當(dāng)有單個(gè)脫氧核苷酸加載在DNA聚合酶上形成新的化學(xué)鍵時(shí)，這個(gè)脫氧核苷酸上的熒光物質(zhì)被激活而發(fā)光，從而被顯微鏡觀測(cè)到。這種特定顏色的熒光只持續(xù)一小段時(shí)間，應(yīng)為這個(gè)堿基在DNA鏈上合成之后，它的熒光基團(tuán)就會(huì)被剪切掉，從而繼續(xù)下一個(gè)堿基的合成。當(dāng)DNA鏈合成結(jié)束之時(shí)也是DNA鏈測(cè)序完成之時(shí)。但DNA聚合酶的活性會(huì)在激光照射下逐漸減弱，不能無限長(zhǎng)度的進(jìn)行合成反應(yīng)，因此DNA鏈的測(cè)序長(zhǎng)度也是有限的。

文庫(kù)制備: Fragment, Mate-pair (250bp-6kb)

模板制備: SMRTbell™ library, 無需常規(guī)擴(kuò)增，1kb以下的文庫(kù)只需要500ng樣品

讀長(zhǎng): 1000bp

測(cè)序通量: 高靈活性的測(cè)序通量

時(shí)間/run: 模板制備到 primary basecall analysis只需不到一天,一般只需要不到4個(gè)小時(shí).

堿基精確度: 準(zhǔn)確率社會(huì)評(píng)價(jià)不高，2011年1月發(fā)表的NEJM雜志（關(guān)于海地霍亂的測(cè)序）在其supplementary提到它的單堿基準(zhǔn)確率只有81-83%。

關(guān)于其準(zhǔn)確率的社會(huì)評(píng)價(jià)不好，有網(wǎng)站稱其準(zhǔn)確度很差，單次測(cè)序平均錯(cuò)誤率15%，循環(huán)測(cè)序后降至8%

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP、Indel、SV、CNV，可以直接進(jìn)行甲基化等修飾測(cè)序，方便表觀研究

成本: $700,000 per machine，$99 per SMRTTMCell, each patterned with 15,000ZMW, each ZMW contain a single DNA polymerase.

數(shù)據(jù)格式: bas.h5 – Base File and Filtered Bases File - Documentation

cmp.h5 – Reference Mapped File and Consensus File - Documentation

分析軟件: mapping：BLASR (Basic Linear Alignment with Successive Refinement)；組裝：ALLORA (A Long Read Assembler)；SNP 和Indel ： RCCS (Reference Circular Consensus Sequencing) 客戶端軟件：SMRT Portal；提供：experiment specific, data-rich reports in industry-standard output formats containing both primary and secondary analysis data�？梢允褂玫谌�方軟件。

優(yōu)點(diǎn): 讀長(zhǎng)長(zhǎng)；無需PCR擴(kuò)增，也避免了由此帶來的bias；需要的樣品量很少；樣品制備時(shí)間花費(fèi)少；用RS系統(tǒng)可以遠(yuǎn)程快速獲取數(shù)據(jù)和選擇測(cè)序參數(shù)；通量靈活；時(shí)間快

缺點(diǎn): 準(zhǔn)確性低，需要循環(huán)測(cè)序，

經(jīng)典案例: The Origin of the Haitian Cholera Outbreak StrainChen-Shan Chin,et al.N Engl J Med 2011; 364:33-42January 6, 2011.

Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.John Eid, et al.Science 2 January 2009:

Vol. 323 no. 5910 pp. 133-138

DOI: 10.1126/science.1162986

備注: 1.在樣品制備好后，有一個(gè)run design的步驟，可以在客戶電腦上用RS remote 軟件來自主選擇運(yùn)行方式和后續(xù)的個(gè)性化分析服務(wù)，以及第一時(shí)間接受測(cè)序數(shù)據(jù)2.截止2011年5月份已正式發(fā)售了多臺(tái)RS測(cè)序儀，其中包括美國(guó)國(guó)家生化防衛(wèi)分析與對(duì)策中心（NBACC）和冷泉港實(shí)驗(yàn)室。

8.PGM

企業(yè): Ion Torrent

推出時(shí)間: 2010年

主流型號(hào): Ion Personal Genome Machine™（2010年）

樣品要求: 5 μg DNA，起始DNA體積不超過130μL

測(cè)序原理: 半導(dǎo)體芯片測(cè)序

該測(cè)序儀使用了一種高密度半導(dǎo)體小孔芯片。該芯片置于一個(gè)離子敏感層和離子感受器之上，每當(dāng)有核苷酸分子被摻入時(shí)就會(huì)釋放出質(zhì)子，而離子感受器就會(huì)感受到這種信號(hào)，知道是哪一個(gè)核苷酸被摻入，從而讀出DNA序列。

文庫(kù)制備: Fragment(185–210 bp)

模板制備: PCR擴(kuò)增

讀長(zhǎng):

314芯片，100 bp；

316芯片，100bp；

318芯片，200 bp。

測(cè)序通量:

314芯片，10 Mb/run；

316芯片，100 Mb/run；

318芯片，1Gb/run。

時(shí)間/run: 2 hours

堿基精確度: 一致性超過99.99%，>99.5% raw accuracy.

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面): SNP, Indel

成本: 儀器$50,000 /臺(tái)，測(cè)序$500/run

數(shù)據(jù)格式: 標(biāo)準(zhǔn)的SFF或者FASTAQ格式

分析軟件: 一系列商業(yè)軟件進(jìn)行變異檢測(cè)，denovo組裝

優(yōu)點(diǎn): 無以倫比的快速，2個(gè)小時(shí)完成測(cè)序工作；Ion Torrent的化學(xué)測(cè)序原理自然簡(jiǎn)單，無修飾的核苷酸、無激光器或光學(xué)檢測(cè)設(shè)備，因而可達(dá)到極小的測(cè)序偏差和出色的測(cè)序覆蓋均衡度。

缺點(diǎn): 測(cè)序通量目前還不夠大，增加半導(dǎo)體芯片的容量將有望提高測(cè)序儀的處理能力。

經(jīng)典案例: 1德國(guó)大腸桿菌疫情爆發(fā)之后，華大基因利用第三代測(cè)序儀——Ion Torrent進(jìn)行了該大腸桿菌的全基因組測(cè)序。在獲得病毒樣本后三天的時(shí)間內(nèi)，華大基因完成了對(duì)該新型大腸桿菌的基因組測(cè)序。經(jīng)過初步信息分析，發(fā)現(xiàn)該菌株是一種新的兼具侵襲、產(chǎn)毒、腸出血等特征的大腸桿菌。

備注: 特別適合微生物基因組測(cè)序及擴(kuò)增子重測(cè)序

9.MiSeq

企業(yè): Illumina

推出時(shí)間: 2011年

主流型號(hào): MiSeq Personal Sequencing System（2011年）

樣品要求: 使用Nextera，50 ng DNA；使用TruSeq，100 ng–1 μg DNA

測(cè)序原理: 邊合成邊測(cè)序

這種測(cè)序技術(shù)通過將基因組DNA的隨機(jī)片斷附著到光學(xué)透明的表面，這些DNA片斷通過延長(zhǎng)和橋梁擴(kuò)增，形成了具有數(shù)以億計(jì)cluster的Flowcell，每個(gè)cluster具有約1000拷貝的相同DNA模板，然后用4種末端被封閉的不同熒光標(biāo)記的堿基進(jìn)行邊合成邊測(cè)序。這種新方法確保了高精確度和真實(shí)的一個(gè)堿基接一個(gè)堿基的測(cè)序，排除了序列方面的特殊錯(cuò)誤，能夠測(cè)序同聚物和重復(fù)序列。

文庫(kù)制備: Fragment

模板制備: 橋式擴(kuò)增

讀長(zhǎng):

1*35 bp

2*100 bp

2*150 bp

測(cè)序通量:

1*35 bp >120 Mb/run

2*100 bp >680 Mb/run

2*150 bp >1 Gb/run

時(shí)間/run:

擴(kuò)增測(cè)序總時(shí)間：

1*35 bp 4 hours

2*100 bp 19 hours

2*150 bp 27 hours

堿基精確度:

>90% bases higher than Q30 at 1*35 bp

>80% bases higher than Q30 at 2*100 bp

>75% bases higher than Q30 at 2*150 bp

變異檢測(cè)能力(DNA重測(cè)序方面):

成本: N/A

數(shù)據(jù)格式: 儀器$125,000/臺(tái)，測(cè)序$750/run

分析軟件: *.bcl, FASTQ, BAM, *.vcf和*.csv.

優(yōu)點(diǎn): 樣品制備簡(jiǎn)單快速，在一臺(tái)儀器上完成測(cè)序和數(shù)據(jù)處理；可靠的化學(xué)方法，可逆中止堿基邊測(cè)序邊合成法

缺點(diǎn): N/A

經(jīng)典案例: N/A

備注: 特別適合擴(kuò)增子測(cè)序、克隆檢查和小基因組測(cè)序

來源：生物文摘