概述
    轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)是一種參與解碼mRNA、翻譯蛋白質(zhì)的接頭分子。近年來的研究表明tRNA還能作為小非編碼RNA (sncRNA)的主要來源之一，具有獨特且多樣的功能1。這些tRNA來源的ncRNA并非隨機降解的產(chǎn)物，而是通過精確的生物發(fā)生過程產(chǎn)生的 (圖.1) 。源自tRNA的ncRNA大致分為兩大類：tiRNA (或者tRNA halves) 和tRFs (tRNA 衍生片段) ，具有其特定的分子大小、核苷酸組成、生理功能以及生物發(fā)生^1-3。
   
    tRNA halves (tiRNAs)是由angiogenin (ANG)在多種應(yīng)激條件下在成熟tRNA的反密碼子環(huán)處特異性切割產(chǎn)生的5’-和3’- tRNA半分子，長度約為29-50nt。
 
    tRFs長度約16-28nt，來源于成熟tRNA或前體tRNA，根據(jù)其在tRNA上的對應(yīng)位置可進(jìn)一步分為：(i) tRF-5，對應(yīng)成熟tRNA的5’端，切割發(fā)生在D-loop；(ii) tRF-3，對應(yīng)成熟tRNA的3’端，包含CCA部分，切割發(fā)生在T-loop；(iii) tRF-1，源自前體tRNA的3’尾部序列，3’末端含有多聚U序列；(iv) i-tRF，不屬于tRF-5，tRF-3或tRF-1，主要來自成熟tRNA的中間區(qū)域。
      
圖1. tRF&tiRNA的生物發(fā)生過程。tRF-1產(chǎn)生于前體tRNA的3’尾端序列。tRF-5，i-tRF和tRF-3分別起源自成熟tRNA的5’、內(nèi)部、和3’端。當(dāng)切割發(fā)生在成熟tRNA反密碼子環(huán)，將產(chǎn)生兩個半分子，tiRNAs，包括5’-tRFs和3’-tRFs。
 
生物功能
    tRFs和tiRNAs作為sncRNA執(zhí)行多種生物學(xué)功能 (圖7) 。它們能夠作為miRNA行使RNA干擾(圖2) ；替換與mRNA結(jié)合的翻譯起始因子eIF4G，直接抑制蛋白的翻譯過程^4,5；結(jié)合某些蛋白因子，例如YBX1，影響mRNA的穩(wěn)定性 (圖3) ；與細(xì)胞色素C相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡⁶；在應(yīng)激條件下促進(jìn)應(yīng)激顆粒 (Stress Granules, SGs) 的組裝 (圖4) ；敏化細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p53激活以及p53依賴的細(xì)胞死亡⁷；作為父代表觀遺傳因子，改變子代基因轉(zhuǎn)錄級聯(lián)過程^8,9 (圖6)
              
圖2.  tRFs具有許多microRNA的功能特性，例如，Dicer依賴的生物發(fā)生，與Argonaute蛋白形成RISC復(fù)合體以及RNA沉默。某些收錄的miRNA直接與tRFs匹配 ¹⁰。

圖3.  tRFs或者其類似物替換腫瘤基因mRNA結(jié)合蛋白YBX1，使許多促癌基因mRNA不穩(wěn)定，進(jìn)而癌細(xì)胞的浸潤性被顯著抑制 ¹¹。
      
圖4.  在細(xì)胞應(yīng)激條件下，tRNA halves (tiRNAs)由angiogenin 切割tRNA產(chǎn)生，隨后促進(jìn)Stress Granules (SGs)的組裝，誘導(dǎo)翻譯抑制，細(xì)胞修復(fù)和存活 ¹²。
 
人類疾病
    tRFs&tiRNAs與多種病理狀況相關(guān)，甚至是致病因素，例如，癌癥、神經(jīng)退行性疾病、遺傳性代謝疾病等 (圖5)。

 
圖 5.  tRFs&tiRNAs 分子功能和人類疾病。

癌癥
    tRFs&tiRNAs在多種癌細(xì)胞系中差異表達(dá)，例如前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和C4-2等。tRFs&tiRNAs在應(yīng)激條件下表達(dá)水平升高，尤其是在缺氧等氧化應(yīng)激條件下¹³。此外，一種在B細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)的tRF-3具有前導(dǎo)RNA的功能特性，以miRNA的方式抑制細(xì)胞增殖，調(diào)控DNA損傷應(yīng)答 ¹⁴。通過競爭YBX1結(jié)合位點、降低腫瘤基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穩(wěn)定性，tRFs&tiRNAs可作為腫瘤抑制物 ¹¹ (圖. 3)。一種來自tRNA-Ser前體的tRF-1 (tRF-1001) 在多種癌細(xì)胞系中高表達(dá)，并且是前列腺癌細(xì)胞增殖所必須的 ¹⁵。ANG產(chǎn)生的tiRNAs促進(jìn)SGs的組裝，幫助細(xì)胞在不利條件下存活，據(jù)推測，ANG誘導(dǎo)的tiRNAs直接貢獻(xiàn)于ANG介導(dǎo)的血管生成和癌細(xì)胞增殖。類似的，tiRNAs能夠結(jié)合細(xì)胞色素C，并幫助癌細(xì)胞逃避細(xì)胞調(diào)亡 ⁶。綜上所述，這些重要發(fā)現(xiàn)強烈預(yù)示了tRFs&tiRNAs在腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用。

獲得性代謝疾病
    不斷增長的證據(jù)表明，子代的代謝疾病可源自親本的飲食習(xí)慣。在一個父本高脂飲食 (HFD) 小鼠模型中的研究顯示，精子中存在一類主要來自tRNA 5’端、長度在30-34nt的tRFs&tiRNAs，在高脂飲食條件下表現(xiàn)出差異表達(dá)和RNA修飾變化。將HFD小鼠精子中的tRFs&tiRNAs組分注射到正常受精卵中，可引起F1小鼠的代謝疾病，改變早期胚胎和胰島細(xì)胞代謝通路基因表達(dá)譜，并且獨立于CpG富集區(qū)DNA甲基化機制。因此，精子tRFs&tiRNAs代表著一類親本的表觀遺傳因子，介導(dǎo)飲食誘導(dǎo)的代謝疾病向子代遺傳 ⁸ (圖. 6)。
   
    限制小鼠飲食蛋白水平能夠改變小鼠成熟精子中小RNA含量，let-7表達(dá)降低，而Glycine tRNA 來源的5’ 端tRFs&tiRNAs表達(dá)量升高。tRFs&tiRNAs被認(rèn)為在著床前胚胎轉(zhuǎn)錄組表達(dá)調(diào)控中起著內(nèi) 源逆轉(zhuǎn)錄驅(qū)動作用⁹。
          
圖 6. 高脂飲食 (HFD) 小鼠精子中tRNA 來源的小RNA (tsRNAs，主要是tRNA halves) 具有變化的表達(dá)譜和RNA修飾。通過受精卵注射技術(shù)，tRFs&tiRNAs賦予了子代代謝疾病表型。這些表觀遺傳因子通過改變從胚胎到成年的基因級聯(lián)轉(zhuǎn)錄過程來介導(dǎo)親本到子代的遺傳過程 ⁸。

神經(jīng)性病變
    許多神經(jīng)性病變是由tRNA代謝或tRNA加工酶缺陷造成的。一種RNA酶活性降低的ANG突變體與致死性神經(jīng)退行性病變Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) 的病理過程相關(guān)聯(lián) ¹⁶。一類ALS相關(guān)的ANG突變體同時還在Parkinson’s Disease (PD)病人中發(fā)現(xiàn) ¹⁷。隨著研究的不斷深入，ANG誘導(dǎo)的tRNA halves與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、神經(jīng)發(fā)育疾病之間的聯(lián)系得到進(jìn)一步加強 ¹⁸。CLP1 RNA激酶活性喪失，導(dǎo)致一種異常加工的酪氨酸t(yī)RNA前體來源的小RNA片段的積累，進(jìn)而敏化細(xì)胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p53激活和p53介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，誘發(fā)運動神經(jīng)元丟失，肌肉去神經(jīng)化以及呼吸衰竭 ⁷。另外一個案例是，5-胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶NSun2的突變引起的頭小畸形 (microcephaly)和其他神經(jīng)性異常。在NSun2缺失突變體大腦皮層、海馬和紋狀體神經(jīng)元中，tRNA 胞嘧啶5位甲基化的缺失，增強ANG對tRNA的結(jié)合和剪切，導(dǎo)致5’-halves的積累，進(jìn)而降低蛋白翻譯速率，激活應(yīng)激通路，減小細(xì)胞體積，促進(jìn)細(xì)胞凋亡¹⁹。

病理應(yīng)激損傷
    由缺氧、營養(yǎng)匱乏、氧化及代謝失衡等引起的應(yīng)激反應(yīng)能夠損傷細(xì)胞，催生疾病。這些應(yīng)激條件刺激tRNA halves的產(chǎn)生。在毒性損傷、輻射以及缺血再灌注等組織損傷動物模型中，tRNA halves的產(chǎn)生與組織損傷程度呈現(xiàn)相關(guān)性，例如，應(yīng)激導(dǎo)致tRNA構(gòu)象改變，隨后促進(jìn)ANG介導(dǎo)的tRNA halves的產(chǎn)生 ¹。5’-halves的表達(dá)上調(diào)與病毒及立克次體感染顯著相關(guān)，可能與抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活有關(guān)。tRFs&tiRNAs、主要是30-35nt長的5’ halves在非惡性肝臟中具有高的表達(dá)量，而且在慢性病毒性肝炎中表達(dá)水平迅速上升¹⁸。

生物標(biāo)志物潛力
    tRFs&tiRNAs的組成和數(shù)量高度依賴于細(xì)胞類型和疾病狀態(tài) ²⁰。特別的，tRNA和tRF&tiRNA類群高度富集與生物體液中，有時甚至高于miRNA的含量 ^13,21,22。盡管目前對體液型生物標(biāo)志物的篩選主要集中在miRNA上，但是，tRFs&tiRNAs在多種體液中的高當(dāng)量高穩(wěn)定性，在病理過程中的廣泛參與，在實體瘤和血液惡性腫瘤中的差異表達(dá)，以及在癌癥病人和正常對照之間的強大分辨能力，為人們嘗試開發(fā)低侵入性的、基于tRFs&tiRNAs的生物標(biāo)志物開辟了廣闊的前景。例如，PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)tRFs&tiRNAs的表達(dá)譜能夠清楚的分辨三陰(陽)性乳腺癌與正常對照 ²⁰ (圖7B，C)；研究顯示，不同tRFs&tiRNAs之間的比例關(guān)系能夠作為一個高效的癌癥無進(jìn)展生存期 (PFS) 指標(biāo)和診斷標(biāo)志物候選者 ¹³。
    
圖7. (A)血漿中存在豐富的tRNA衍生片段RNA21。在PLS-DA判別分析中tRFs&tiRNAs表達(dá)譜能夠清晰的分辨三陽性乳腺癌 (B)以及三陰性乳腺癌 (C)與健康對照。

如何研究tRFs&tiRNAs
    康成生物的tRF&tiRNA–seq服務(wù)系統(tǒng)對tRF&tiRNA進(jìn)行定性定量的表達(dá)譜分析，同時對tRF&tiRNA亞家族及未知tRF&tiRNA進(jìn)行鑒定。借助豐富的數(shù)據(jù)和信息，那些差異表達(dá)的tRFs&tiRNAs能夠被鑒定，并使用圖示的方法進(jìn)行下一步的深入研究 (圖. 8) 。許多已經(jīng)建立好的方法都和miRNA類似，例如，qPCR驗證，LNA寡核苷酸基因敲除，合成的類似物進(jìn)行功能獲得性研究等。

圖8. tRF&tiRNA下一步研究技術(shù)路線。

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