在尋找疾病相關(guān)基因的研究中，使用基因芯片對家系進行連鎖分析，將基因定位于少數(shù)幾個區(qū)域中，接著進行外顯子組測序或全基因組重測序?qū)ふ液蜻x區(qū)域中的遺傳變異，是一個準(zhǔn)確高效的研究方案。本文列舉了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科李明老師團隊的兩項研究，均使用了上述方法成功找到了疾病相關(guān)的基因變異位點。該研究中的Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片和外顯子組測序服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。

研究思路

研究案例

案例一 連鎖分析和重測序揭示Basan綜合征相關(guān)SMARCAD1突變

該研究使用了連鎖分析和全基因組重測序發(fā)現(xiàn)了一個新的SMARCAD1基因選擇性剪切突變，此突變被認為引發(fā)了Basan綜合征。在此研究之前，已有研究在患有Basan綜合征的美國家庭鑒定出了SMARCAD1基因的5個突變。Basan綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，癥狀為可自愈的先天性肢端水皰、粟丘疹、無指紋及掌跖角化過度等。本文的研究對象是一個患有Basan綜合征的家系（見圖1）。具體病征見表1。

圖1.1. 患有Basan綜合征的家系圖譜。箭頭所指為先證者。

表1. 家系中8例患Basan綜合征的臨床表現(xiàn)

研究首先使用了Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片對整個家系樣本進行基因分型。過濾掉低質(zhì)量位點，單態(tài)位點，以及不符合孟德爾定律的位點后，得到11,152個SNPs用于連鎖分析。由于Basan綜合征存在類似遺傳性大皰性表皮松解癥的臨床表現(xiàn)，因此先排除掉已知相關(guān)基因KRT5的突變。隨后連鎖分析得到了兩個相關(guān)區(qū)域，為4p15.31-4p14和4q13.2-4q23。

圖1.2. 全基因組連鎖分析結(jié)果。最高LOD值為3.01。

接下來，研究使用了Agilent SureSelect平臺對其中一例患者進行了外顯子測序，測序深度為100X，但并沒有發(fā)現(xiàn)功能相關(guān)變異。于是作者又進行了全基因組重測序，測序平臺為Illumina Hiseq XTen，測序深度為平均每堿基27.94X，得到了3,832,626個變異位點（SNP和Indel）。在使用1000 Genome、HapMap 8和dbSNP135數(shù)據(jù)庫過濾SNP后，在連鎖分析得到的相關(guān)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)兩個遺傳變異。第一個為c.378 +1G>T，位于SMARCAD1基因的選擇性剪切位點，而另一個則為“GGC”重復(fù)，位于ANKRD17基因的第一外顯子。隨后，作者使用了sanger測序?qū)�這兩個變異在該家系中進行了驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMARCAD1基因的變異與臨床表現(xiàn)呈共分離，但ANKRD17基因與疾病無關(guān)。

本研究的意義在于確定了該家系發(fā)病原因為SMARCAD1基因上發(fā)生的選擇性剪切突變。有研究報道，該突變與無掌紋癥（adermatoglphia，ADG）相關(guān)，說明ADG與Basan綜合征是同一種疾病的不同表現(xiàn)。未來研究將解決該突變的致病機制。

案例二 全基因組連鎖分析和外顯子測序在Dowling-Degos病例中確定KRT5基因突變

Dowling-Degos病是一種色素性疾病，為常染色體顯性遺傳，特征為身體屈側(cè)有網(wǎng)狀色素沉著、顯著的粉刺樣皮疹和凹陷性瘢痕。本研究使用了患有Dowling-Degos病的家系作為研究對象，患者樣本數(shù)量為19個。

圖2.1. 患有Dowling-Degos病的家系圖譜。箭頭所指為先證者。

與上一篇研究類似，作者首先使用了Sanger測序在樣本中排除了包含已知致病基因ABCB6、POFUT1和POGLUT1突變的樣本，隨后使用Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片進行基因分型。連鎖分析將致病基因定位至12q13.12-12q14.1區(qū)域內(nèi)，LOD值為3.19，定位精度為13.76 cM。

圖2.2. Dowling-Degos病致病基因KRT5的定位。（a）單倍型分析；（b）連鎖分析，候選區(qū)域LOD值為3.19；（c）Sanger測序驗證KRT5基因變異

隨后，對其中一例患者，研究者進行了外顯子組測序，平臺為Agilent SureSelect，測序深度為100X。在定位區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了KRT5基因起始密碼子的突變c.2T>G (p.Met1?)和NEUROD4基因的一個錯義突變c.376G>A (p. Ile126Val)。經(jīng)過使用Sanger測序進行突變與疾病的共分離分析，后者被排除，而前者被證明與疾病相關(guān)。

總結(jié)

這兩篇文章均首先使用基因芯片進行了連鎖分析，將候選基因定位于具體的區(qū)段上，再使用全基因組重測序?qū)ふ以搮^(qū)段的遺傳變異。定位到少數(shù)幾個變異后，使用Sanger測序?qū)φ麄�家系樣本進行測序，將基因型與表現(xiàn)型進行共分離分析，排除與疾病無關(guān)的遺傳突變。這種研究方法為遺傳性疾病致病基因搜尋提供了明確的研究思路。

原文出處：
Li M, Wang J, Li Z, et al. Genome-wide linkage analysis and whole-genome sequencing identify a recurrent SMARCAD1 variant in a unique Chinese family with Basan syndrome[J]. European Journal of Human genetics, 2016.

Li M, Wang J, Zhang J, et al. Genome-wide linkage and exome sequencing analyses identify an initiation codon mutation of KRT5, in a unique Chinese family with generalized Dowling–Degos disease[J]. British Journal of Dermatology, 2015, 174(3):663-666.