無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)是指用含有蛋白合成必需的組分（核糖體，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，氨酰合成酶，啟動(dòng)/延伸/終止因子，三磷酸鳥(niǎo)苷，ATP，Mg2+和K+）的細(xì)胞裂解物在體外進(jìn)行蛋白合成。

與傳統(tǒng)的基于細(xì)菌或真核細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)相比較，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，包括節(jié)約時(shí)間、提高具有功能的、可溶的、全長(zhǎng)蛋白的總體產(chǎn)量。此外，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)更適用于激酶等毒性蛋白的表達(dá)、也可使用經(jīng)過(guò)修飾的tRNA來(lái)進(jìn)行標(biāo)記，在某特定位點(diǎn)摻入非天然的氨基酸。同時(shí)，這些系統(tǒng)還可以用于高通量實(shí)驗(yàn)。

快速獲得目的蛋白，從數(shù)天縮短至幾小時(shí)

選擇一個(gè)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，最主要的幾點(diǎn)考慮因素包括細(xì)胞提取物或裂解物的來(lái)源、模板以及期望的蛋白產(chǎn)量，從而選擇適合實(shí)驗(yàn)體系和下游應(yīng)用的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

（一）模板

在使用插入片斷或載體進(jìn)行真核細(xì)胞系統(tǒng)蛋白表達(dá)時(shí)，有以下幾個(gè)因素需要考慮：(i) ATG起始密碼子應(yīng)該是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的第一個(gè)ATG密碼子；(ii) 理想化而言，在啟動(dòng)子之后，ATG應(yīng)該包含在Kozak共有序列之內(nèi)；(iii) 在模板序列的3'端應(yīng)包含終止密碼子；(iv) 終止密碼子之后應(yīng)帶有合成的多聚A尾(2)。此外，使用TNT® T7麥胚偶聯(lián)系統(tǒng) (TNT® T7 Coupled Wheat Germ System) 時(shí)，載體還應(yīng)包含一個(gè)T7終止子序列或該載體呈線性化。

在原核系統(tǒng)中，起始密碼子的選擇幾乎無(wú)一例外地依賴于核糖體結(jié)合位點(diǎn) (ribosomal binding site, RBS) 的存在，這個(gè)位點(diǎn)包含了閱讀框架的起始信號(hào)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點(diǎn)能夠大大提高原核細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)。原核系統(tǒng)不識(shí)別位于ATG起始密碼子上游的任何ATG，除非這些ATG含有一個(gè)處于合適位置的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物 (Rabbit Reticulocyte Lysate, RRL) 時(shí)，DNA介導(dǎo)的蛋白合成與mRNA為起始的蛋白合成相比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：當(dāng)進(jìn)行高水平的蛋白合成時(shí)，不需要處理mRNA的繁雜操作過(guò)程。

（二）基于真核細(xì)胞RNA的翻譯

在1950至1960年間，研究人員證實(shí)了兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物可以經(jīng)過(guò)人為操作，用于外源mRNA介導(dǎo)的蛋白合成，這樣可以只把感興趣的蛋白合成出來(lái)。經(jīng)過(guò)核酸酶處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和Flexi®兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物均增加了一些添加劑，為mRNA的翻譯過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。這些添加劑包括氯高鐵血紅素—用于防止亞鐵血紅素調(diào)節(jié)的elF-2α激酶(HRI)的激活作用；能量生成系統(tǒng)，含有經(jīng)過(guò)測(cè)試的磷酸肌酸激酶和磷酸肌酸；以及小牛肝臟tRNA—用于平衡消耗的tRNA種類，這樣可以優(yōu)化密碼子的使用，并擴(kuò)大可被高效率翻譯的mRNA的范圍。與經(jīng)過(guò)核酸酶處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物相比較，F(xiàn)lexi®兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)可提供更強(qiáng)的靈活性，能夠?qū)⒎�譯反應(yīng)的很多參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，這些參數(shù)包括Mg2+濃度、K+濃度，以及DTT的存在與否。

麥胚提取物 (Wheat Germ Extract，WGE) 含有合成蛋白所需要的細(xì)胞組分 (tRNA、核糖體、起始因子、延長(zhǎng)因子以及終止因子)。該提取物系統(tǒng)做了進(jìn)一步優(yōu)化：添加了由磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶組成的能量生成系統(tǒng)；添加了亞精胺，用于加強(qiáng)蛋白鏈延長(zhǎng)的效率，以防止蛋白鏈的終止過(guò)早地發(fā)生；添加了醋酸鎂，并使其濃度適合大多數(shù)種系mRNA的翻譯。最后，還單獨(dú)提供了醋酸鉀，以用于優(yōu)化更多種類的mRNA。

麥胚提取物適用于表達(dá)小分子的蛋白，或用于表達(dá)富含于兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中的蛋白。當(dāng)RNA制備物中含有少量的dsRNA或硫醇時(shí)，該系統(tǒng)也很適用，上述這些物質(zhì)具有抑制翻譯的作用。在表達(dá)植物蛋白、酵母蛋白或其它真菌蛋白時(shí)，研究人員也會(huì)發(fā)現(xiàn)麥胚提取物比兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物更合適。

（三）基于真核細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯

二十世紀(jì)九十年代，偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯 (即TNT®) 系統(tǒng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，該系統(tǒng)包含兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物或麥胚提取物，并帶有T7、T3或SP6 RNA聚合酶，這些系統(tǒng)使基于DNA的蛋白合成成為現(xiàn)實(shí)。

TNT®兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng) (TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Transcription/Translation Systems) 和TNT®快速轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng) (TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Systems) 僅需一個(gè)試管，即能夠以質(zhì)粒為模板轉(zhuǎn)錄和翻譯蛋白。常規(guī)的TNT®偶聯(lián)系統(tǒng)中的不同組分以單獨(dú)包裝提供，包括三種氨基酸混合物：甲硫氨酸缺失的混合物、半胱氨酸缺失的混合物或亮氨酸缺失的混合物。TNT®快速偶聯(lián)系統(tǒng)提供一個(gè)混合母液，包含所有的反應(yīng)組分 (包括甲硫氨酸缺失的氨基酸混合物)，減少了加樣步驟，節(jié)約了時(shí)間。TNT® T7 PCR DNA快速系統(tǒng) (TNT® Quick for PCR DNA) 是為PCR反應(yīng)產(chǎn)生的線性DNA模板而特別設(shè)計(jì)，這樣的模板比質(zhì)粒DNA模板往往要求更高的鉀離子和鎂離子濃度。

TNT® 快速系統(tǒng)應(yīng)用簡(jiǎn)要圖解

對(duì)于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)反應(yīng)，除兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物之外，TNT®麥胚提取物系統(tǒng) (TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems) 是又一個(gè)選擇，后者也是單個(gè)試管的反應(yīng)模式。普通的麥胚提取物通常是利用SP6，T3或T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子在體外合成RNA，然后再進(jìn)行翻譯反應(yīng)。與此不同的是，TNT®麥胚提取物系統(tǒng)將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)直接整合到翻譯反應(yīng)混合物中。

（四）基于原核細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯

E. coli S30提取物系統(tǒng) (E. coli S30 Extract Systems) 是從E. coli B菌株制備而來(lái)，該菌株中omp T 胞內(nèi)蛋白酶和lon蛋白酶活性缺失。這種缺失能夠大大提高被表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性，否則，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白會(huì)被蛋白酶所降解。E. coli S30提取物系統(tǒng)能夠表達(dá)更多量的蛋白，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，由于宿主編碼的抑制劑的激活，這些蛋白的表達(dá)量很低。E. coli S30提取物的DNA模板可以是線性的，也可以是環(huán)狀的。線性DNA為模板的S30提取物 (E. coli S30 Extract System for Linear Templates) 是從E.coli B菌株中制備的，該菌株核酸外切酶V (recBCD enzyme) 缺失。以線性DNA為模板的S30提取物比以環(huán)狀DNA為模板的S30提取物 (E.coli S30 Extract System for Circular DNA) 和T7 S30提取物 (E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA) 的活性低。在使用這些系統(tǒng)時(shí)，研究人員僅需準(zhǔn)備帶有適當(dāng)?shù)脑�核�?xì)胞啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的克隆DNA即可。

Promega無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)分類

真核無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)：

√ 兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物系統(tǒng)

√ 昆蟲(chóng)細(xì)胞提取物系統(tǒng)

√ 麥胚提取物系統(tǒng)

原核無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)：

√ 大腸桿菌提取物系統(tǒng)