蛋白質（Protein）是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細胞，作為生命的物質基礎之一，蛋白質在催化生命體內各種反應進行、調節(jié)代謝、抵御外來物質入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關重要的作用，因此蛋白質也是生命科學中極為重要的研究對象。

現代研究結果發(fā)現越來越多的多肽同蛋白質一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質序列測定方法支持這些研究的進行�，F有的肽和蛋白質測序方法包括N末端序列測定的化學方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質序列測定標準方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯 PITC分析法，測序速度較慢，通量低；樣品用量較大，對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別等。C末端化學降解測序法則由于無法找 到PITC這樣理想的化學探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質譜（Mass spectrometer）由于相對 較高的靈敏度、準確性、易操作性、快速性及較好的普適性而倍受科學家的廣泛應用。

蛋白的質一級結構式氨基酸序列，通過鑒定氨基酸序列來匹配它的蛋白質，這是定性研究，是蛋白質組學研究的基礎。現在蛋白質組學基本研究手段是：以生物質譜技術為核心，對蛋白質進 行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。現代質譜一般由離子源（Ion source）、質量分析器（Mass analyzer）和離子檢測器（Detector）三部分組成。

在對簡單蛋白質樣本，比如雙向凝膠（2D gel）蛋白質點、單維膠（1D gel）切割下來的蛋白質條帶（Band）以及純化蛋白等，均可選用離子源為電噴霧電離（ESI）或者基質輔助激光解吸離子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）的質譜來進行鑒定。ESI原理是在噴霧器頂端施加一個電場給微滴提供凈電荷，在高電場下，液滴表面產生高的電應力，使表面被破壞產生微滴。荷電微滴中溶 劑的蒸發(fā)，微滴表面的離子“蒸發(fā)”到氣相中，進入質譜儀。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶 薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。

1. 如果選擇MALDI-TOFTOF進行蛋白質鑒定，需要提供多少樣品？ 

如果是考染的2D膠點或者是條帶，只要是肉眼可見均可保證一個比較好的成功率�；蛘咛峁┐笥�200 fmol（或 10ng左右50kDa左右的蛋白質）鑒定成功率也很高。如果是溶液或者是凍干樣品，蛋白質含量至少需要100ng。

2.蛋白膠點鑒定時，2-DE采用銀染染色的方法，請問哪些銀染試劑會對后續(xù)的質譜鑒定產生影響？ 

銀染試劑里不要使用戊二醛，因為它會對蛋白進行修飾，這樣會影響后續(xù)的蛋白鑒定。該染色方法見與質譜兼容銀染染色方法。

3.怎樣減少角蛋白的污染？

角蛋白的污染主要來自于頭發(fā)和皮屑，所以在實驗和切膠過程中應帶好手套和頭套。

4. 膠點需要合并嗎？

對于考染樣品只要肉眼可見一個膠點即可。銀染樣品建議4個單獨點合并，但一般情況下我們建議銀染樣品用

LC-MSMS進行鑒定。

5. 關于樣品保存時間問題？ 

我們推薦是新鮮制備的樣品馬上進行質譜鑒定。銀染樣品的保存時間最好不好超過2個月，考染樣品可以保存幾個月以上，但是最好也不要超過6個月。

6. 接受已經酶解的樣品嗎？除了Trypsin酶以外，會用其他的酶進行酶解嗎？

我們不接收已經酶解好的樣品，因為我們內部有嚴格的酶解QC控制，需要我們來操作酶解。一般情況下我們會選擇單一的Trypsin進行酶解，如果需要其他的酶進行酶解，請與我們提前聯(lián)系。

7. 小分子量蛋白怎么進行鑒定？ 

一般如果分子量范圍在20kDa以上，我們推薦用MALDI-TOFTOF進行鑒定；如果是20kDa以下，我們推薦用

LC-MSMS進行鑒定。

8. 樣品寄送問題？

膠點或條帶樣品直接置入1.5mL EP管中（EP最好為進口，如果沒有進口可聯(lián)系我們，我們免費寄送進口EP管）， 在管蓋寫好樣品編號，管中不需要加任何液體，填好樣品等級表可常溫寄送。其他純化或凍干樣品，如果再常溫下穩(wěn)定的話可以常溫寄送，如果不穩(wěn)定建議干冰運送。

9. 膠點鑒定結果與跑出的雙向蛋白圖譜比較，發(fā)現有些蛋白質得分最高的點分子量或等電點與圖譜上不對應，相差 較大，請問在這種情況下，該如何判斷一個膠點中給出的幾個甚至十幾個點蛋白中哪個蛋白可信度最高？ 

蛋白質譜鑒定是通過肽段歸并到蛋白，因此有些鑒定到的蛋白可能是目標蛋白的同源蛋白或該蛋白的一亞基，而蛋白的人為或天然修飾、降解等情況都會影響該蛋白出現在膠圖中的位置。一般來講，Mascot鑒定得分越高，可信度 就越高，其次可以結合分子量、等電點、肽段覆蓋率等信息篩選可信度高的蛋白質。