高效的生物工藝開發(fā)與優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DOE）是對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行組織、計(jì)劃、執(zhí)行和統(tǒng)計(jì)分析的最具價(jià)值的高效方法之一。雖然可以通 過在單一生物反應(yīng)器內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得DoE結(jié)果，但設(shè)計(jì)開發(fā)并行實(shí)驗(yàn)的微型生物反應(yīng)器系統(tǒng)（如 ambr15 或ambr250系統(tǒng)）為完成DoE提供了更優(yōu)異經(jīng)濟(jì)的條件。由于工藝開發(fā)過程中涉及到眾多互相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，如細(xì)胞系的建立，培養(yǎng)基篩選以及反應(yīng)器操作參數(shù)的優(yōu)化等，DoE 逐漸成為獲得工藝知識(shí)重要且可或缺的方法。DoE 僅提高了工藝開發(fā)效率，還被用于協(xié)助確定高品質(zhì)產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：有效策略

在生物制藥工藝中，縮短開發(fā)時(shí)間和降低生產(chǎn)成本是關(guān)鍵的目標(biāo)。在此背景下，工藝分析技術(shù)（PAT）工具與靈活可靠的生物工藝開發(fā)設(shè)備的聯(lián)合應(yīng)用便成了有效優(yōu)化現(xiàn)有生產(chǎn)工藝和開發(fā)新工藝的基礎(chǔ)。FDA鼓勵(lì)使用PAT來更好地理解和控制生產(chǎn)過程，基于統(tǒng)計(jì)的DoE方法則被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化條件，用最少時(shí)間和實(shí)驗(yàn)量獲得最佳工藝條件的過程中（1）。

DoE概念即根據(jù)一系列計(jì)劃好的實(shí)驗(yàn)同步改變工藝參數(shù)，然后通過一個(gè)已驗(yàn)證的數(shù)學(xué)模型來說明結(jié)果。該模型后續(xù)可用于解釋、預(yù)測和優(yōu)化，還可助于更好地理解工藝。對(duì)比每次改變一個(gè)因素的單因素實(shí)驗(yàn)，DoE方案可以用最少的實(shí)驗(yàn)量獲得最優(yōu)化得結(jié)果，因此可以縮短開發(fā)時(shí)間，減少人工投入。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基組份的優(yōu)化對(duì)形成最佳的重組細(xì)胞系生長及合成活性藥物蛋白環(huán)境至關(guān)重要（2）。另一個(gè)影響工藝開發(fā)的關(guān)鍵目標(biāo)是優(yōu)化基本工藝參數(shù)，如溫度、pH和溶氧（3）。通常，培養(yǎng)基和工藝參數(shù)的優(yōu)化是密切相關(guān)的，DoE正好勝任此類任務(wù)（1）。

從培養(yǎng)基和補(bǔ)料開發(fā)轉(zhuǎn)移至工藝優(yōu)化

除去特定細(xì)胞系的產(chǎn)率，培養(yǎng)基對(duì)藥物蛋白和單克隆抗體的產(chǎn)量和效價(jià)有著重要影響。細(xì)胞需要大量和微量營養(yǎng)糖組合，如糖，無機(jī)鹽，維生素，氨基酸和其它支持細(xì)胞生長和蛋白生產(chǎn)的成份等。由于每一種細(xì)胞都具有獨(dú)特的營養(yǎng)需求，以及培養(yǎng)基成分復(fù)雜，采用具有高通量平行實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Φ奈⑿头磻?yīng)器系統(tǒng)成為打破工藝開發(fā)瓶頸的有力手段。

以往基礎(chǔ)和補(bǔ)料培養(yǎng)基配方的確定是通過逐次改變因素的大量經(jīng)驗(yàn)性試驗(yàn)摸索獲得的（4）。這種方法雖然簡單便捷，但是它忽略了成份之間的相互作用，可能無法獲得最佳配方，而且相當(dāng)費(fèi)時(shí)。應(yīng)對(duì)的最佳策略就是采用高通量微型反應(yīng)器結(jié)合 DoE 設(shè)計(jì)方法來縮短培養(yǎng)基開發(fā)時(shí)間。
除了改進(jìn)培養(yǎng)基組份，補(bǔ)料控制策略的優(yōu)化對(duì)流加工藝也是有利的。實(shí)際方法取決于生物反應(yīng)器系統(tǒng)本身和細(xì)胞系。而一個(gè)經(jīng)典的持續(xù)補(bǔ)料的 流加策略已被證明可成功應(yīng)用于大腸桿菌和巴斯德畢赤酵母的培養(yǎng)。出于控制簡單和可放大的考慮，哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)采用階梯式推進(jìn)補(bǔ)料方法是行業(yè)內(nèi)最普遍的做法（5, 6）。
擁有 12 或 24 個(gè)一次性攪拌反應(yīng)器的新 ambr250 工作站（TAP Biosystems公司，賽多利斯子公司之一），是一種有效的應(yīng)用于微生物發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)早期工藝開發(fā)高通量比例縮小模型。該系統(tǒng)所具備的能力包括連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)視和控制關(guān)鍵參數(shù)，增加的補(bǔ)料取樣選項(xiàng)，使得它比傳統(tǒng)小試和中試反應(yīng)器相比，具有等效但更高 效的工藝放大效果（7–9）。
自動(dòng)化工作站的特點(diǎn)是具有一個(gè)集成液體處理器，它可以移除一次性容器的蓋子，用于初始培養(yǎng)基的裝載、接種、取樣和補(bǔ)料流加。培養(yǎng)或補(bǔ)料培養(yǎng)基可以通過移液模塊轉(zhuǎn)移預(yù)配方培養(yǎng)基，或者可根據(jù)導(dǎo)入的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)系統(tǒng)自動(dòng)配制不同成份的培養(yǎng)基。除了單次流加（10 μL 至 10 mL） 方式，內(nèi)置泵還允許線性或指數(shù)性地連續(xù)進(jìn)料，范圍從 20 nL/h 到20 mL/h。
一旦最主要的培養(yǎng)基成份和它們的最佳范圍被確定，則工藝可以被轉(zhuǎn)移至一個(gè)較大的小試規(guī)模系統(tǒng)中進(jìn)行驗(yàn)證可放大性，并繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化操作 參數(shù)和工藝條件。
Biostat® B-DCU II 臺(tái)式生物反應(yīng)器（Sartorius Stedim Biotech）是一種專門設(shè)計(jì)用于六個(gè)玻璃反應(yīng)器或一次性 反應(yīng)器并行實(shí)驗(yàn)的小試系統(tǒng)。它在行業(yè)中被廣泛用于工藝優(yōu)化和驗(yàn)證（10）。每個(gè)反應(yīng)器都有獨(dú)立的控制參數(shù)和自動(dòng)測量功能。系統(tǒng)經(jīng)預(yù)先配置，可立即使用，并且它們可以用于微生物發(fā)酵或細(xì)胞培養(yǎng)。

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1.重組蛋白優(yōu)化表達(dá)：案例研究
2. 通向成功的流程
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結(jié)論

高通量細(xì)胞培養(yǎng)的縮小生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如 ambr15 和 ambe250 系統(tǒng)，可提高篩選的效率與有效性，以及工藝開發(fā)和工藝表征的實(shí)踐。它們提供 的優(yōu)勢(shì)在于以較小的培養(yǎng)體積同時(shí)進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)的操作。與此同時(shí)，小規(guī)模的一次性攪拌釜容器能夠提供與大規(guī)模生物反應(yīng)器具有優(yōu)異可比性的培養(yǎng)環(huán)境和生物反應(yīng)器性能（7–9）。摒棄試錯(cuò)優(yōu)化的傳統(tǒng)方式，采用先進(jìn)的DoE 方法，實(shí)現(xiàn)快速、有效的地鑒定關(guān)鍵工藝參數(shù)，促使成本的顯著降低與開發(fā)時(shí)間的大量縮減。

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