一、Annexin V 檢測(cè)凋亡細(xì)胞膜的改變

試劑及溶液：

A 對(duì)于單獨(dú)購(gòu)買的試劑：

   a) 10X Binding Buffer （貨號(hào)：556454）
   b) Propidium Iodide（PI，貨號(hào)：556463）：建議與以下試劑同時(shí)使用 Annexin V-FITC（貨號(hào)： 556420,556419）或 Annexin V-Biotin （貨號(hào)： 556418，556417） 
   c) Via-Probe? （貨號(hào)：555816 ）：核酸染料7-AAD。建議與以下試劑同時(shí)使用Annexin V-PE（貨號(hào)：556422，556421）或Annexin V-Biotin（貨號(hào)：556418，556417）。 
   d) 1X PBS Buffer （貨號(hào)： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 7H20, 0.24 g KH2PO4 ,加水至1L。 調(diào)整pH值至 7.2。 高壓滅菌室溫保存。

B．對(duì)于凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：556547）

   a) FITC Annexin V （組分編號(hào)： 51-65874X）：每個(gè)樣本5 μl用量。
   b) Propidium Iodide （PI，組分編號(hào)： 51-66211E)）：現(xiàn)成的核酸染料。每個(gè)樣本5 μl用量。 
   c) 10X Annexin V Binding Buffer（組分編號(hào)： 51-66121E）

操作步驟：

  1. 取Falcon試管，按標(biāo)本順序編好陰性對(duì)照管和標(biāo)本管號(hào)。
  2. 使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用1xBinding Buffer緩沖液制成1x106細(xì)胞/ml的懸液。
  3. Falcon試管中加入100μl 細(xì)胞懸液。
  4. 按以下體積加入AnnexinV與核酸染料：

  5．輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置15分鐘。
  6．*使用Annexin V-Biotin試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí): 
    ● 1xBinding Buffer緩沖液洗細(xì)胞一次，去上清。 
    ● 1xBinding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細(xì)胞管中。 
    ● 輕輕混勻。加入5μl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。 
  7．各試驗(yàn)管中分別加入1xBinding Buffer緩沖液400μl。1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。

Annexin V Blocking

待測(cè)細(xì)胞與未標(biāo)記的重組Annexin V預(yù)孵育，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，是Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)的質(zhì)量控制。原理是預(yù)先阻斷Annexin V-FITC的結(jié)合位點(diǎn)，這樣可以證明Annexin V-FITC凋亡分析的特異性。

   1. 使用冷的PBS緩沖液洗細(xì)胞兩次，再用1xBinding Buffer緩沖液制成1x106細(xì)胞/ml的懸液。 
   2. 在5ml的培養(yǎng)管中加入100μl細(xì)胞懸液（約1x105個(gè)細(xì)胞）。 
   3. 加入5-15μg純化的重組Annexin V。注意，不同的細(xì)胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點(diǎn)飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達(dá)到最好效果，可以減少細(xì)胞數(shù)量，0.5x105個(gè)細(xì)胞加5-15μg純化的重組Annexin V。 
   4. 輕輕混勻，室溫反應(yīng)15分鐘。 
   5. 加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。 
   6. 各試驗(yàn)管中分別加入1xBinding Buffer緩沖液400μl。 
   7. 1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果。 

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