通過(guò)生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降 解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。

 

在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencingcomplex, RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過(guò)程。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離 siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.

實(shí)驗(yàn)步驟

1. siRNA的設(shè)計(jì)

1) 在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下網(wǎng)站進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：

2) RNAi目標(biāo)序列的選取原則：

A.從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開(kāi)始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié) 合mRNA從而影響siRNA的效果。

B. 將潛在序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

C. 選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

3) 陰性對(duì)照
一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒(méi)有明顯的同源性。通常做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性。

4) 目前已證實(shí)的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到：

2. siRNA的制備
目前為止較為常用的方法有通過(guò)化學(xué)合成，體外轉(zhuǎn)錄，長(zhǎng)片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解體外制備siRNA，以及通過(guò)siRNA表達(dá)載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。

1) 體外制備

A. 化學(xué)合成
許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成siRNA。主要的缺點(diǎn)包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成3-4對(duì)siRNAs 的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。
最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究
不適用于：篩選siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素

B. 體外轉(zhuǎn)錄
以DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受 到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng) 的時(shí)間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成siRNA所能達(dá) 到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。

最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。
不適用于：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的siRNA。長(zhǎng)期研究。

C. 用RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備siRNA
其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計(jì)和檢驗(yàn)多個(gè)siRNA序列以便找到一個(gè)有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs“混 合雞尾酒” 就可以避免這個(gè)缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNaseIII (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒(méi)有被消化的dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn) 染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點(diǎn)在于可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過(guò)這種方法的缺點(diǎn)也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因�，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示 這種情況通常不會(huì)造成影響。

最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型
不適用于：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療(gene therapy)

2) 體內(nèi)表達(dá)
前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)。而采用siRNA表達(dá)載體和基于PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作RNA。

A. siRNA表達(dá)載體
多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpinRNA,shRNA)在哺乳動(dòng)物(mammal;mammalian)細(xì)胞中的表達(dá)。這三類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和 人H1啟動(dòng)子。之所以采用RNApolIII啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物(mammal;mammalian)細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA，而且它是 通過(guò)添加一串（3到6個(gè)）U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的polIII 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。

siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究——帶有抗生素(antibiotic)標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。
病毒載體也可用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。

最適用于：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。
不適用于：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。

B. siRNA表達(dá)框架
siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè)RNApol III啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個(gè)RNA pol III終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。和siRNA表達(dá)載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以 直接由PCR得到，不用一天的時(shí)間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和siRNA的最適搭配。 如果在PCR兩端添加酶切位點(diǎn)，那么通過(guò)SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定 表達(dá)siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。

這個(gè)方法的主要缺點(diǎn)是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問(wèn)題）②不能進(jìn)行序列測(cè)定，PCR和DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。

最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子
不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

3. siRNA的轉(zhuǎn)染
將制備好的siRNA，siRNA表達(dá)載體或表達(dá)框架轉(zhuǎn)導(dǎo)至真核細(xì)胞中的方法主要有以下幾種：

1) 磷酸鈣共沉淀
將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復(fù)合物粘附到細(xì)胞膜并通過(guò)胞飲進(jìn)入目的細(xì)胞 的細(xì)胞質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對(duì)于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。在實(shí)驗(yàn)中使用的每種試劑都必須小心校準(zhǔn)，保證質(zhì)量，因?yàn)樯踔疗�離最優(yōu)條件十分之一個(gè)pH都會(huì) 導(dǎo)致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

2) 電穿孔法
電穿孔通過(guò)將細(xì)胞暴露在短暫的高場(chǎng)強(qiáng)電脈沖中轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。將細(xì)胞懸浮液置于電場(chǎng)中會(huì)誘導(dǎo)沿細(xì)胞膜的電壓差異，據(jù)認(rèn)為這種電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜暫時(shí)穿孔。電脈 沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^(guò)高的場(chǎng)強(qiáng)和過(guò)長(zhǎng)的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。一般，成功的電穿孔過(guò)程都伴隨高水平（50% 或更高）的毒性。

3) DEAE-葡聚糖和polybrene
帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復(fù)合物和帶負(fù)電的DNA分子使得DNA可以結(jié)合在細(xì)胞表面。通過(guò)使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA復(fù)合體導(dǎo)入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖僅限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

4) 機(jī)械法
轉(zhuǎn)染技術(shù)也包括使用機(jī)械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細(xì)針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核�；�因槍使用高壓microprojectile將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。

5) 陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑
在優(yōu)化條件下將陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑加入水中時(shí)，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到 DNA的磷酸骨架上以及帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面。因此使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑，DNA并沒(méi)有預(yù) 先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的DNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物。據(jù)稱，一個(gè)約5kb的質(zhì)粒會(huì)結(jié)合2-4個(gè)脂質(zhì)體。被 俘獲的DNA就會(huì)被導(dǎo)入培養(yǎng)的細(xì)胞�，F(xiàn)存對(duì)DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)原理的證據(jù)來(lái)源于內(nèi)吞體和溶酶體。

古朵生物提示您注意事項(xiàng)：
1. 純化siRNA
2. 避免RNA酶污染
3. 健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性
4. 避免使用抗生素(antibiotic)
5. 選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑
6. 通過(guò)合適的陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測(cè)條件
7.通過(guò)標(biāo)記siRNA來(lái)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)