上海交通大學(xué)領(lǐng)銜的系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心聯(lián)合來自我國血液/腫瘤臨床多中心研究機(jī)構(gòu)（M-HOPES）的17家醫(yī)院，最近在淋巴瘤發(fā)病原理和臨床預(yù)后研究方面獲得了重要的標(biāo)志性成果，充分體現(xiàn)了多中心多學(xué)科協(xié)同創(chuàng)新、造福患者的宗旨。

自然殺傷/T細(xì)胞淋巴瘤（natural killer T-cell lymphoma，NKTCL）是一種CD56+/cytoCD3+淋巴細(xì)胞惡性增殖的特殊類型淋巴瘤。該病與EB病毒（Epstein-Barr virus）感染密切相關(guān)，在亞洲地區(qū)人群中相對高發(fā)，發(fā)病兇險，預(yù)后很差。但由于此病發(fā)病機(jī)制一直未能闡明，給尋找疾病特異的生物學(xué)標(biāo)志和治療手段，切實(shí)改善該型淋巴瘤的療效帶來重大挑戰(zhàn)。來自系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心的上海血液學(xué)研究所聯(lián)合全國17家醫(yī)院協(xié)同合作，對NKTCL這一具有獨(dú)特地域性和臨床特征的血液腫瘤進(jìn)行了基因組學(xué)、分子病理學(xué)和臨床預(yù)后相關(guān)性研究，取得了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的突破性成果。

圖2、研究小組利用全外顯子測序和目標(biāo)基因測序?qū)�NKTCL病例進(jìn)行突變篩查

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中調(diào)控RNA結(jié)構(gòu)和功能的一個重要基因-RNA解旋酶DDX3X基因在NKTCL中存在高頻突變，且其突變率居于各基因突變的首位，抑癌基因TP53突變頻率次之，兩種基因突變率相加占全部基因突變的32.4%；而DDX3X與TP53基因突變存在互相排斥作用，提示兩者的致病機(jī)理有高度相關(guān)性。蛋白和細(xì)胞功能研究顯示，野生型DDX3X蛋白具有下調(diào)核RelB表達(dá)和降低細(xì)胞ERK磷酸化水平的作用，使細(xì)胞增殖受抑，具有抑癌基因產(chǎn)物的特征，而DDX3X突變則導(dǎo)致其編碼的蛋白功能失活，引起細(xì)胞過度增殖。

圖3 NKTCL病例中DDX3X基因的突變 (a) DDX3X基因突變位點(diǎn)圖譜；(b) DDX3X蛋白在不同種屬中的序列比對結(jié)果

該研究還在大組病例中證實(shí)DDX3X基因突變是患者預(yù)后不良的分子標(biāo)志，同時，結(jié)合TP53突變以及淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)（International Prognostic Index , IPI）情況，可進(jìn)一步將NKTCL患者分為三組：低危組（IPI指數(shù)0-1且DDX3X及TP53為野生型）、中危組（IPI指數(shù)0-1且DDX3X及TP53為突變型；IPI指數(shù)2-5且DDX3X及TP53為野生型）及高危組（IPI指數(shù)2-5且DDX3X及TP53為突變型）。這些結(jié)果使NKTCL臨床預(yù)后判斷分層更為清晰和嚴(yán)謹(jǐn)，并為該病的分層精準(zhǔn)治療提供潛在的靶點(diǎn)。

2015年7月20日《自然-遺傳學(xué)（Nature Genetics）》雜志報道了這項(xiàng)研究結(jié)果，這是迄今為止NKTCL最全面系統(tǒng)的基因組學(xué)圖譜，也是對相關(guān)突變基因致病原理及其臨床意義進(jìn)行的深入系統(tǒng)闡述，表明中國科學(xué)家在淋巴瘤研究領(lǐng)域已經(jīng)躋身于世界一流行列，并為推動淋巴瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出重要貢獻(xiàn)。

技術(shù)評論：

二代測序和其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展極大的推動了腫瘤基因組學(xué)的研究，這為解析腫瘤發(fā)生機(jī)制、制定臨床診斷和治療方法提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。由于腫瘤組織具有很強(qiáng)的異質(zhì)性，對測序有較高的深度要求，外顯子組測序和目標(biāo)基因測序可以解決這一問題。在本項(xiàng)研究中，研究小組先用外顯子組測序進(jìn)行小范圍篩查（25例），發(fā)現(xiàn)DDX3X、TP53等一系列較高突變頻率的基因，然后用目標(biāo)基因測序在較大樣本量中（80例）驗(yàn)證這些基因的突變。這一技術(shù)路線是目前較為通行的做法，既節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本、簡化了數(shù)據(jù)分析流程又保證了樣本量和測序深度。

通常，目標(biāo)基因測序的手工建庫是非常繁瑣的，該研究中使用的Access Array（Fluidigm）微流控平臺大大簡化了目標(biāo)基因的建庫工作。一張48.48 Access Array芯片具有2304個PCR反應(yīng)倉，每個反應(yīng)倉可以進(jìn)行1~10重的PCR反應(yīng)。利用它，研究者可以同時對48個樣本進(jìn)行48~480個目標(biāo)序列的擴(kuò)增和建庫。在此基礎(chǔ)上，2015年Fluidigm公司即將推出Orion-Juno多功能微流控建庫平臺以滿足研究者們不同研究項(xiàng)目的需求。應(yīng)用于此平臺的192.24 芯片可同時針對192個樣本的1000~2500個目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增和建庫，能夠使研究者們在一次測序反應(yīng)中完成更多的樣本測序，而一張48.48芯片可針對每個樣本完成高達(dá)約5000個目標(biāo)序列的建庫，滿足研究者高覆蓋度的研究需求。

可以預(yù)見，隨著相關(guān)技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來測序和建庫的實(shí)驗(yàn)成本和人力成本將進(jìn)一步降低。無論對于基礎(chǔ)研究還是臨床研究，這都將產(chǎn)生更加深遠(yuǎn)的影響。

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