在藥物研發(fā)早期進(jìn)行心急毒性評(píng)價(jià)是非常重要的，以便于排除潛在的有毒副作用的化合物，從而開(kāi)展進(jìn)一步的研究。高度預(yù)測(cè)性的生物相關(guān)性體外高通量篩選分析實(shí)驗(yàn)對(duì)于提高效率和降低心臟安全性評(píng)價(jià)失敗的化合物篩選的高成本來(lái)說(shuō)是至關(guān)重要的。干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞是特別完美的細(xì)胞模型，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)了GPCRs 和離子通道，表現(xiàn)出自發(fā)的類似原始心肌細(xì)胞的機(jī)械的和電學(xué)活性。

 

EarlyTox^TM心急毒性試劑盒包含一個(gè)新型的鈣離子敏感染料和一個(gè)專有的進(jìn)過(guò)優(yōu)化的屏蔽技術(shù)，用來(lái)檢測(cè)與心肌細(xì)胞跳動(dòng)關(guān)聯(lián)的的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的變化。跳動(dòng)模式的信號(hào)特征表現(xiàn)時(shí)間很短。由于相機(jī)曝光時(shí)間短,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子結(jié)合染料產(chǎn)生的信號(hào)比標(biāo)準(zhǔn)的鈣流分析實(shí)驗(yàn)小。這種新配方的試劑盒比其它商用鈣染料能提供更強(qiáng)的信號(hào)。如圖1 中所示，起到屏蔽作用的分子不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但降低了細(xì)胞外背景熒光信號(hào)。這些特性有助于提高信號(hào)窗口，為心肌跳動(dòng)波形圖檢測(cè)提供更多詳細(xì)信息。

 

 

 

 

這個(gè)檢測(cè)分析試劑盒可用于分析藥物對(duì)峰值頻率（BPM）、峰值幅度和跳動(dòng)波形圖的影響，且被設(shè)計(jì)為用于干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞或原代心肌細(xì)胞。峰值頻率取決于EarlyTox 心肌毒性染料監(jiān)測(cè)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。在單個(gè)的心跳周期內(nèi)，肌質(zhì)網(wǎng)被激活后Ca²⁺被釋放進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)。鈣結(jié)合肌鈣蛋白激活肌小節(jié)，引起細(xì)胞收縮。同步地，細(xì)胞中染料分子與游離的鈣離子結(jié)合增加了熒光信號(hào)強(qiáng)度。

 

心肌細(xì)胞舒張發(fā)生于鈣離子泵把細(xì)胞內(nèi)的鈣離子攝取回肌質(zhì)網(wǎng)并和細(xì)胞外液進(jìn)行鈣離子交換時(shí)。熒光信號(hào)強(qiáng)度隨著鈣離子濃度降低而減小。隨著下一個(gè)心跳周期重復(fù)開(kāi)始，熒光信號(hào)峰值隨著心跳同步被記錄。

 

使用EarlyTox^TM心急毒性試劑盒在FLIPR^Tetra 系統(tǒng)中已經(jīng)對(duì)心肌細(xì)胞的鈣離子峰值頻率和非典型波形圖的濃度依賴性調(diào)控方式進(jìn)行了驗(yàn)證， 并通過(guò)ScreenWorks®Peak Pro 軟件作進(jìn)一步的分析。確證參數(shù)的改變，如鈣離子峰值頻率、振幅、峰寬、增長(zhǎng)和衰減的時(shí)間有助于對(duì)構(gòu)效關(guān)系（SAR）方向修正或者排除化合物進(jìn)入藥物化學(xué)或臨床前研發(fā)的評(píng)判。另外，這種方法還可以用于作用于心臟的新化合物開(kāi)發(fā)。

 

在生物相關(guān)性心急毒性分析實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行功能性研究

最大限度減少染料對(duì)心肌細(xì)胞跳動(dòng)特性的非特異性影響

在最大的可用信號(hào)中觀察時(shí)間分辨率

無(wú)需幾小時(shí)，在數(shù)分鐘內(nèi)檢測(cè)384 個(gè)樣品

 

本實(shí)驗(yàn)中所使用的心肌細(xì)胞，來(lái)源于Cellular Dynamics International 的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）分化的心肌細(xì)胞，根據(jù)建議的方案進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞被培養(yǎng)在黑壁底透的384 孔板中10~14 天。EarlyTox Cardiotoxicity Explorer Kit (R8210) 染料加載緩沖液加熱至37°C 以避免降低心肌細(xì)胞的跳動(dòng)。加入25μL 染料至多孔板中每孔25μL 的細(xì)胞體系中。細(xì)胞板放置于5% CO2，37℃條件下孵育2 小時(shí)。

 

試劑盒中含有三個(gè)參考化合物——普萘洛爾、異丙腎上腺素和索他洛爾，用于驗(yàn)證iPS C 心肌細(xì)胞不同刺激下的反應(yīng)狀態(tài)。準(zhǔn)備好的化合物板中藥物的每個(gè)檢測(cè)濃度是終濃度的5 倍并在加樣前加熱至37℃，以減少溫度對(duì)細(xì)胞的影響。當(dāng)在FLIPR^Tetra中系統(tǒng)添加化合物后，可以對(duì)細(xì)胞跳動(dòng)頻率和波形圖觀察記錄持續(xù)4~6 小時(shí)�；�合物添加后繼續(xù)記錄10 分鐘。可以額外記錄讀取幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)直至4 個(gè)小時(shí)的信號(hào)。

 

對(duì)照和EarlyTox 心肌試劑盒中的三個(gè)參考化合物的峰值頻率和跳動(dòng)波形圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2~5。

 

 

 

多種鈣離子指示染料以及其各自在細(xì)胞跳動(dòng)、平均峰值振幅以及峰值頻率等方面的作用進(jìn)行了4小時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)比較。這些染料包括EarlyTox心急毒性染料, FLIPR. Calcium 5 試劑盒 (Molecular Devices)和Fluo-4 Direct 試劑盒(Invitrogen)。根據(jù)供應(yīng)商產(chǎn)品說(shuō)明，染料加入iPSC 心肌細(xì)胞中共孵育。使用FLIPRTetra系統(tǒng)對(duì)加樣前和加樣后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果進(jìn)行記錄。此實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置了對(duì)照孔。如圖6 和7 中所示， 所有EarlyTox 心急毒性染料的峰值頻率和信號(hào)振幅均是最高的。圖8 中可以看到，EarlyTox 心急毒性染料對(duì)化合物添加后4 小時(shí)內(nèi)細(xì)胞跳動(dòng)能力（消失）沒(méi)有影響。FLIPR Calcium 5 染料作用下的多數(shù)細(xì)胞停止跳動(dòng)，而Fluo-4 Direct 染料在加入化合物90 分鐘后所有孔均停止跳動(dòng)。

 

 

 

 

 

 

EarlyTox 心肌毒性染料已進(jìn)行優(yōu)化，可以提供更強(qiáng)信號(hào)、高通量方法來(lái)檢測(cè)藥用化合物對(duì)干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的效應(yīng)。優(yōu)化了的染料成分可以產(chǎn)生更大的信號(hào)窗口和顯著的降低試劑自身對(duì)心肌跳動(dòng)、峰值頻率或信號(hào)振幅等隨著時(shí)間變化的很小的非特異性毒性作用，有別與其它類型的試劑染料。EarlyTox 心肌毒性染料配套FLIPRTetra 系統(tǒng)使用，是藥物研發(fā)早期檢測(cè)化合物心肌毒性和確證潛在心臟候選藥物發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)大工具。