當(dāng)需獲得高質(zhì)量、多種參數(shù)的數(shù)據(jù)時(shí)，我們需要一種能夠進(jìn)行復(fù)雜的基于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的儀器來(lái)提高數(shù)據(jù)獲取速度。這里我們通過(guò)一系列基于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的結(jié)果，來(lái)介紹一款將細(xì)胞成像系統(tǒng)和多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)整合于一體的儀器，它即能夠提高檢測(cè)的通量，也能夠增加檢測(cè)數(shù)據(jù)的豐富度。此儀器即為Molecular Devices公司最新推出的SpectraMax® MiniMax™ 300，其標(biāo)配有一個(gè)白色透射光通道和兩個(gè)熒光檢測(cè)通道。其專利的免染料標(biāo)記的細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，可通過(guò)其白色透射光通道對(duì)微孔板內(nèi)沒(méi)有標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行精確計(jì)數(shù)，幫助分析細(xì)胞增殖、分化和化合物對(duì)細(xì)胞的毒性影響等情況。其標(biāo)配的兩個(gè)熒光通道大大提高了此儀器的檢測(cè)范圍，包括檢測(cè)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞活力/細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化或者細(xì)胞周期。分析軟件中使用了全新的邏輯運(yùn)算方式來(lái)識(shí)別細(xì)胞，可以簡(jiǎn)化分析過(guò)程并且可輸出更多種參數(shù)數(shù)據(jù)：細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞匯合度、平均和完整的細(xì)胞面積、平均和完整的熒光信號(hào)強(qiáng)度。我們列舉了幾種基于細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的實(shí)例。我們展示了如何利用全新的細(xì)胞成像系統(tǒng)來(lái)更好的服務(wù)于生物學(xué)的研究，基于此平臺(tái)的基礎(chǔ)上發(fā)展了幾種即適合生物制藥企業(yè)也適合研究中心的檢測(cè)方法。

SpectraMax® MiniMax™ 300細(xì)胞成像系統(tǒng)

·         可結(jié)合SpectraMax® I3多功能微孔板檢測(cè)系統(tǒng)；

·         熒光&透射光模塊；

·         簡(jiǎn)便的操作來(lái)源于其全自動(dòng)化設(shè)計(jì)

·         專有固態(tài)照明

·         高靈敏度的CCD相機(jī)

·         專有的激光自動(dòng)聚焦方式

·         優(yōu)異均一性&對(duì)比度

·         專業(yè)的SoftMax® Pro軟件

 

 

根據(jù)Protocol要求將Hela細(xì)胞種在96孔板中(4000 cell/well)，使用抗癌化合物處理細(xì)胞48小時(shí)以后，用MinMax成像系統(tǒng)的透射光通道獲取細(xì)胞圖像，并且在無(wú)需染料的情況下，僅通過(guò)軟件的邏輯運(yùn)算功能就可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或得出細(xì)胞覆蓋面積的百分比。使用SoftMax6.4軟件直接獲得IC50值，可在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集。

 

使用來(lái)自于Cellular Dynamics International(CDI)公司的由ipsc(誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞)分化的肝細(xì)胞，按照其要求種在微孔板中。使用膠原包被的9 6 孔板， 其中細(xì)胞密度為60000 cell/well，或者使用膠原包被的384孔板，其中細(xì)胞密度為15000 cell/well，培養(yǎng)2-3天，然后用相應(yīng)化合物刺激細(xì)胞72小時(shí)。使用Calcein(活細(xì)胞檢測(cè)試劑盒，Invitrogen)或者使用鬼筆環(huán)肽共軛連接的AF488(固定細(xì)胞，BD試劑盒)染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，使用MinMax成像系統(tǒng)獲得圖像后，利用軟件邏輯運(yùn)算功能分析細(xì)胞的增殖情況。

 

將造血干細(xì)胞(CD34+細(xì)胞，Lonza)種在96孔板中，然后加入細(xì)胞因子指示劑和抗癌藥物后培養(yǎng)5天。使用Cell Tracker Green(Invitrogen)或抗血型糖蛋白A(anti-Glycophorin A)(BD試劑盒)。成像后的細(xì)胞，使用軟件自帶模塊來(lái)分析細(xì)胞的數(shù)目。

 

全新的SpectraMax MinMax 300成像系統(tǒng)可以幫助用戶按照自己的需要輕松設(shè)置試驗(yàn)，然后快速進(jìn)行檢測(cè)。此系統(tǒng)具有強(qiáng)大的獲取、分析圖像的功能， 得益于圖像分析行業(yè)領(lǐng)導(dǎo)軟件MetaMorph，我們將其核心分析功能整合進(jìn)了SoftMax Pro軟件中。用戶可以根據(jù)自己特定試驗(yàn)的需求從若干個(gè)應(yīng)用模版中進(jìn)行選擇，再去獲取和分析圖像。

 

 

透射光成像功能對(duì)于基于細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的試驗(yàn)非常具有吸引力，原因在于其無(wú)需標(biāo)記，且僅需要較短的曝光時(shí)間，不同時(shí)間點(diǎn)都可以檢測(cè)且對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷。然而，在透射光條件下對(duì)許多連接緊密的細(xì)胞進(jìn)行分割是一個(gè)非常大的挑戰(zhàn)，因?yàn)榧?xì)胞與背景的對(duì)比度很低，這樣就需要軟件具有強(qiáng)大的邏輯運(yùn)算能力。這里，我們介紹具有專利的無(wú)標(biāo)記細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)儀器的學(xué)習(xí)能力簡(jiǎn)化圖像的分析設(shè)置，它可以適用于很多不同種類的細(xì)胞。

 

 

細(xì)胞增殖/毒性，通過(guò)癌細(xì)胞(HeLa)增殖情況來(lái)評(píng)價(jià)抗癌藥物的療效

透射光條件下的無(wú)標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)功能，進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)可在不同時(shí)間點(diǎn)獲得結(jié)果。使得可以選擇不同時(shí)間點(diǎn)記錄抗增殖藥物或者生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的作用效果，繪出濃度效應(yīng)學(xué)曲線并給出IC₅₀s值，而且重要的是整個(gè)過(guò)程不需要染細(xì)胞進(jìn)行觀察，試驗(yàn)過(guò)程并不會(huì)影響細(xì)胞正常變化。

 

 

 

 

肝細(xì)胞毒性分析試驗(yàn)使用誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞(ipsc)分化的肝細(xì)胞作為研究對(duì)象。使用若干種肝毒性藥物對(duì)這些細(xì)胞處理72小時(shí)后，我們使用Calecin或者鬼筆環(huán)肽偶聯(lián)的AF-488評(píng)價(jià)細(xì)胞的活力，毒性檢測(cè)的評(píng)價(jià)方法可以根據(jù)細(xì)胞區(qū)域面積變化或細(xì)胞數(shù)目的變化，黃曲霉毒素、十字袍堿、依托泊苷和其他肝毒性化合物的IC₅₀s值的確定，檢測(cè)試驗(yàn)的窗口大約為200，Z值＞0.9。

 

 

我們?cè)O(shè)計(jì)出一個(gè)非常適合檢測(cè)生長(zhǎng)因子和抗癌藥物對(duì)造血作用影響的試驗(yàn)，我們將造血干細(xì)胞中加入不同的生長(zhǎng)因子進(jìn)行培養(yǎng)，此外，可以用來(lái)評(píng)價(jià)幾種抗癌藥物的作用效果，使用標(biāo)記有FITC細(xì)胞系特異性的抗體進(jìn)行染色或者使用細(xì)胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)。可以用于檢測(cè)許多表達(dá)譜系特異性標(biāo)記物的細(xì)胞或全部細(xì)胞數(shù)目，IC₅₀s由不同因素所決定。試驗(yàn)窗口(assay window)＞100，Z值＞0.7。

 

 

·         不同的細(xì)胞因子組合對(duì)CD34+細(xì)胞培養(yǎng)情況影響

·         使用細(xì)胞示蹤綠色染料(Cell Tracker Green)(針對(duì)全部細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù))或A型血糖蛋白(標(biāo)記紅色祖細(xì)胞)

 

 

·         CD34+細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入促紅細(xì)胞生成素(EPO)和抗癌藥物

·         細(xì)胞計(jì)數(shù)(擴(kuò)增/毒性)