遺傳病家系的高通量測序：您需要了解的一些事
摘要
高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)與普及，為遺傳病的研究帶來了前所未有的機會。它提高了遺傳病致病基因克隆和鑒定的效率，使人類對自身基因功能的認識大大加速。本文對遺傳病家系的高通量測序分析提出一些注意事項，希望有助于相關(guān)的研究。
前言
我國是一個多民族的人口大國，也是遺傳病家系資源比較豐富的國家之一。遺傳病家系是生命科學基礎(chǔ)理論探索和實際應用研究的寶貴材料，是解讀人類基因功能的重要證據(jù)。依賴于對遺傳病家系的連鎖分析，對致病基因進行定位克隆曾經(jīng)是研究遺傳病致病基因的重要手段。通過連鎖分析對致病基因進行精細定位，往往不容易實現(xiàn)，這需要較大或較多的家系。因此，遺傳病致病基因的定位克隆并不容易。近十年來，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)與普及，為遺傳病的研究帶來了前所未有的機會。它提高了遺傳病致病基因克隆和鑒定的效率，使人類對自身基因功能的認識大大加速。技術(shù)上的進步，使得近幾年全世界范圍內(nèi)遺傳病研究成果迅速涌現(xiàn)，國際上相關(guān)科研論文的發(fā)表量也連年快速上升。在國內(nèi)，許多科研團隊準備或者已經(jīng)用高通量測序技術(shù)對所收集的遺傳病家系進行分析。上海伯豪生物在多年從事高通量測序技術(shù)服務的基礎(chǔ)上，對遺傳病家系的高通量測序分析提出一些注意事項，希望有助于相關(guān)的研究。
一．遺傳病家系信息的收集及樣本的采集
對所感興趣的遺傳病事先進行充分的了解是非常重要的。它是真正的遺傳病嗎？遺傳病由遺傳物質(zhì)改變引起，可在家族內(nèi)聚集，但有些在家族內(nèi)群發(fā)的疾病并非遺傳病。它的發(fā)病頻率有多少？發(fā)病頻率的大小涉及到高通量測序數(shù)據(jù)的過濾分析，需要注意。它是單基因遺傳病還是復雜性狀遺傳�。亢笳叩难芯侩y度較大。如果研究者不是相關(guān)專業(yè)的醫(yī)生，與醫(yī)療機構(gòu)的臨床�？漆t(yī)生或遺傳咨詢醫(yī)生合作將非常有助于即將進行的研究。合作可以使研究者在短時間內(nèi)快速了解該遺傳病，也可以使其有機會接觸更多的該種遺傳病的家系。
遺傳病家系信息的收集及樣本的采集直接影響研究項目的進度。對家系信息的收集，應盡可能全面、確鑿，盡量避免信息的漏檢和誤錄。盡可能邀請疾病家系中熟悉家族歷史沿革和各個成員狀況的代表參加患病家系的信息咨詢，如果條件允許，可邀請數(shù)位代表同時參加，以確保信息來源準確。要注意家系中過繼、后續(xù)親屬的情況或近親結(jié)婚的情況。有些家系成員，盡管已經(jīng)去世，但通過他人盡可能地了解該成員是否有患病癥狀，仍然很重要，因為這些信息可能幫助判定疾病遺傳方式。全面準確的家系信息有助于判定致病基因的傳遞類型，有助于高通量測序個體的挑選和數(shù)據(jù)分析，而測序?qū)ο蟮倪x擇和數(shù)據(jù)分析直接影響項目進度。有些家系比較小，不利于疾病位點的連鎖分析定位，但仍然有應用價值。高通量測序不一定需要很大的家系；而且，可以利用多個同類疾病的小家系，進行綜合研究。
對家系成員疾病癥狀的仔細檢查、全面描述與詳細記錄也很重要。有些遺傳病與其它遺傳病有類似的或者重疊的癥狀，詳細而充分的描述可以避免對遺傳病病種的誤判，避免研究出現(xiàn)方向性錯誤。一些遺傳病，具有遺傳和表型的異質(zhì)性，不同基因的突變，雖然導致同一種疾病，但疾病癥狀有差異。這些癥狀的差異提示著致病位點的不同。精細、豐富的癥狀信息能為基因功能研究提供更多的線索。遺傳病癥狀信息如此重要，以至于有人曾提出“人類表型組計劃（The Human Phenome Project）”。
對遺傳病家系樣品的采集，應按知情同意和無害有利的原則，盡量一次采到足夠量的材料，避免重復采樣給家系成員帶來情感和機體上的傷害，也避免因?qū)嶒灢牧喜粔蜓诱`項目進程。有時，因家系成員遷移或去世等原因，重復采樣并不能實現(xiàn)，那么，一些必要的實驗只得放棄，這必然影響項目進展。采樣時，既要采集家系中患者的樣本，也要采集與患者有關(guān)的正常人的樣本。
有些遺傳病研究，可能需要從采集的樣品中抽取RNA進行高通量測序。.那么，此時對樣品的采集和處理方式則可能與DNA測序所需的樣品有所不同。這也是需要注意的。
二. 從遺傳病家系中選擇合適的測序?qū)ο?/B>
遺傳病家系中患者和正常人的樣品采集好后，是否應對家系中每一位患者都進行全外顯子組測序或全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其致病變異，從而發(fā)現(xiàn)其致病基因呢？不一定。而且，這樣做花費也比較大。有時，僅對少數(shù)患者的測序即可大幅縮小致病位點的搜尋范圍。如果致病基因的較詳細的定位信息已經(jīng)通過其它方法得到，有時只需測定一位病人就可發(fā)現(xiàn)致病位點。對于呈孟德爾方式遺傳的遺傳病，疾病在家系中的傳遞方式，影響著測序個體的選擇和測序數(shù)據(jù)的分析策略。
常染色體隱性遺傳病基因的克隆最先受益于高通量測序技術(shù)。對于一個常染色體隱性遺傳病家系，如果不存在近親結(jié)婚或生殖隔離等因素，往往患者同一致病基因的不同位點存在致病突變，即患者帶有復合雜合突變（compound heterozygous mutations）。由于這類患者一般不多，可以對同胞患者及其正常雙親進行測序，分析時尋找子代復合雜合變異與雙親雜合變異共有的部分，從而發(fā)現(xiàn)致病位點。有時，僅對一對同胞對（sibpair）或一位患者進行測序即可發(fā)現(xiàn)常染色體隱性遺傳病致病基因。對于近親結(jié)婚或生殖隔離等因素導致的常染色體隱性遺傳病，患者致病基因往往存在純合突變，而患者的雙親往往是突變基因的雜合子。這時應當在搜尋在患者中呈純合狀態(tài)而在雙親中呈雜合狀態(tài)的變異。在這種情況下，患者雙親的親緣關(guān)系越遠，越有利于尋找致病位點。有時只測一位患者也可發(fā)現(xiàn)致病基因。
疾病呈X連鎖遺傳方式傳遞的家系也適于高通量測序分析。這類家系有利于縮小致病基因搜尋范圍，因為許多常染色體上的變異被排除了。譬如，對于X連鎖隱性遺傳病，可以對男性患者和及其母親（致病突變攜帶者）進行測序，尋找X染色體上共有的的變異。然而，需要注意的是，有時X連鎖與常染色體隱性遺傳方式不易區(qū)分（當后者的家系中只有男性患者時），在進行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析時需要注意。此時，前已述及的對家系中更多成員的調(diào)查就顯得重要了。
高通量測序技術(shù)用于顯性遺傳病致病基因搜尋的難度比較大，尤其對于常染色體顯性遺傳病。常染色體顯性遺傳病，致病基因的變異在雜合狀態(tài)下即可發(fā)病。常染色體雜合的變異往往很多，不容易縮小搜尋范圍。如果有相關(guān)基因的較精細的位置信息（例如小于2Mb的范圍）可以參考，則測定少數(shù)（甚至一個）患者即可確定致病位點。否則，則需要測定較多的患者。當確實需要對家系內(nèi)多個患者進行測序時，盡可能選擇親緣關(guān)系較遠的（如圖1所示）。也可以對家系中的患者和正常人進行測序，在數(shù)據(jù)分析時，在前者發(fā)現(xiàn)的雜合變異中，除去那些在后者中存在的雜合變異，余下的部分則包含致病變異。
圖1. 顯示本家系中對親緣關(guān)系較遠的患者(III-2和III-4)的測序比對親緣關(guān)系較近的患者（II-2和II-3）測序更容易發(fā)現(xiàn)致病突變位點（摘自Hinchcliffe MJ. Managing incidental findings in exome sequencing for research. Methods Mol Biol. 2014;1168:207-25.）
對于某些新生突變（de novo mutations）所致遺傳病致病基因的搜尋則比較容易。對該類突變的患者及其雙親（parent-child trios）進行測序，即可檢出在患者中出現(xiàn)而在雙親中沒有的、為數(shù)不多的變異。多測幾個家系即可鎖定致病基因（有時兩個家系即可）。如果沒有雙親樣品，也可通過對多個患者的測序找出致病基因。有時只測一個患者也有可能發(fā)現(xiàn)新生突變。
總之，充分利用家系信息和疾病基因的已有定位信息進行高通量測序，既可減少測序花費，也有利于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
三．高通量測序結(jié)果的確認與驗證
一次人類全基因組測序給出的未經(jīng)過濾的變異位點可達三四百萬個；一次人類全外顯子組測序給出的原始變異位點可達2-5萬個。從這些位點中尋找出真正導致所研究的疾病的變異猶如大海撈針。對于全外顯子測序來說，通過測序質(zhì)量（如至少覆蓋的reads數(shù)等）、變異位置、變異類型、最小等位基因頻率（minor allele frequency, MAF）等指標的過濾，可選擇的變異數(shù)可降至數(shù)千。將這些變異再與公開發(fā)布的已知變異數(shù)據(jù)庫或?qū)嶒炇覂?nèi)部建立的變異數(shù)據(jù)庫比較，則可將候選變異數(shù)再降低至數(shù)百。如果對一個家系中多個患者或攜帶者進行測序，還可通過綜合分析，進一步降低候選變異數(shù)，從而使真正的變異“水落石出”。實際上，這一過程存在例外情況和變量。有些控制指標如測序質(zhì)量的控制、最小等位基因頻率的設(shè)定是人為可調(diào)的。這些例外情況和變量影響著最終給出的數(shù)據(jù)大小和質(zhì)量，造成測序結(jié)果的假陽性或假陰性的出現(xiàn)。
高通量測序結(jié)果的某種意義上的可變性、非唯一性，決定了測序結(jié)果驗證的必要性。對于序列本身的變化當然可以用一代測序的方法進行驗證。這并不困難。但對遺傳病家系測序（無論是一代測序還是高通量測序），所檢出的變異，在功能認可上出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果時有發(fā)生。Bell C.J等 2011年報道，在406個已發(fā)表的聲稱引起嚴重遺傳病的突變中，有122個（占27%）要么只是一些普通的多態(tài)，要么缺乏致病性的證據(jù)。另外一些報道則發(fā)現(xiàn)正常對照人群中存在不少致病變異。一些報道的所謂的致病變異被后續(xù)的研究所質(zhì)疑，更多的假陽性可能還未被發(fā)現(xiàn)。錯誤的、不全面的結(jié)論對于遺傳病的基礎(chǔ)研究和臨床診療危害非淺。這提示對測得的變異或變異所在的基因進行功能研究很重要。當然，這種對家系中有些變異的功能的錯誤解讀，并非只有高通量測序才有。需要對變異所在的基因和變異本身，從遺傳學、生物信息學等角度加以考察，并結(jié)合相關(guān)實驗，才能得出與功能（致病性）相關(guān)的結(jié)論。任何致病性方面的結(jié)論得出時都是需要謹慎考慮的。
結(jié)語
高通量測序技術(shù)用于遺傳病致病基因的克隆鑒定，是近幾年的事情。它省去了對基因的作圖定位等煩瑣步驟，省時省力。在中國這樣的遺傳資源大國，該技術(shù)應用前景廣闊。本文提到了遺傳病研究采用高通量測序技術(shù)時需要注意的一些問題，希望對讀者有所幫助。
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