固相合成法制備抗原肽環(huán)肽

瀏覽次數(shù)：1364　發(fā)布日期：2014-12-15　來(lái)源：http://www.ontoresinc.com/

1.1 儀器與試劑
    多肽合成儀(CS536，美國(guó)CSBio公司)，半制備型高效液相色譜儀(Waters Delta Prep4000，美國(guó)Waters公司)，分析型高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)Agilent公司)，冷凍干燥機(jī)(Christ Alpha，德國(guó)Christ公司)，激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LCQ Deca，美國(guó)ThermoFinnigan公司)，紫外分光光度計(jì)(Beckman DU7400，美國(guó)Beckman公司)，C18反相分析柱(Sepax GPC18，5μm，120，4.6mm×150mm)。
    實(shí)驗(yàn)所用FmocProMerrifield Resin(取代值0.291mmol/g，交聯(lián)度1%，100～200目)、BocValWang Resin(取代值0.523mmol/g，交聯(lián)度1%，100～200目)、FmocProCTC Resin(取代值0.42mmol/g，交聯(lián)度1%，100～200目)、BocTyr(tBu)OH、BocProOH、BocIleOH、BocLeuOH、FmocTyr(tBu)OH、FmocProOH、FmocIleOH、FmocLeuOH、Bocstatine(3s，4s)OH、HATU［O(7偶氮苯并三氮唑1氧)N，N，N′，N′四甲基脲六氟磷酸酯］、HBTU(苯并三唑1四甲基六氟磷酸酯)、HOBt(N羥基苯并三唑)、BOP(鄰苯二甲酰丁辛酯)、DIEA(N，N二異丙基乙胺;二異丙基乙胺)、TFA(三氟乙酸)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲亞砜)、DCM(二氯甲烷)、ACN(乙腈)、EDC［1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽］、NMM(N甲基嗎啉)和苯甲硫醚均由杭州中肽生化有限公司提供，哌啶經(jīng)重蒸后使用，水為二次去離子水。
    1.2 HS1及其類似物的化學(xué)合成
    本文所合成的5種環(huán)肽序列分別為：
    HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6Pro7
    Leu8)；
    A1HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3Pro4Tyr5Val6
    Pro7Leu8)；
    A2HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3statine4Tyr5Val6
    Pro7Leu8)；
    A3HS1：cyclo(Ile1Ile2Pro3Pro4Tyr5Val6
    statine7Leu8)；
    A4HS1：cyclo(Ile1Ile2statine3statine4Tyr5
    Val6Pro7Leu8)。
    雖然這5種抗原肽環(huán)肽或環(huán)肽類似物的序列如上面所表示的非常相似，并且按照順序給每個(gè)氨基酸殘基做了編號(hào)，但考慮到每個(gè)化合物的疏水性和空間位阻可能并不完全相同，加之合成的線性肽鏈終究要環(huán)化成抗原肽環(huán)肽，因此，為了方便、有效地合成目的產(chǎn)物，我們選擇接肽反應(yīng)的第一個(gè)氨基酸也不盡相同。
    (1)HS1的合成路線與純化
    樹脂溶脹調(diào)用自編程序Method1，樹脂溶脹的具體方法是將FmocProCTC Resin 4.76g(合成規(guī)模為2.0mmol)用200ml DMF浸泡30min，使之充分溶脹，然后抽干。
    脫除氨基保護(hù)基調(diào)用自編程序Method2，具體方法為加入含20%哌啶的DMF溶液20ml，攪拌反應(yīng)30min，再抽干。然后用DMF洗滌5次，以除去殘留的脫保護(hù)試劑。手工取樣，茚三酮檢測(cè)，若樹脂呈深藍(lán)色，則表明Fmoc保護(hù)基已經(jīng)脫除。
    接肽反應(yīng) 調(diào)用自編程序Method3，具體方法是在反應(yīng)器中加入溶解有3.33g FmocValOH的200ml DMF溶液，機(jī)械攪拌2min，然后加入HBTU 3.57g，最后加入NMM 2.02g［AA∶HBTU∶NMM(mol/mol)=3∶2.85∶6］，反應(yīng)30min。抽干，用DMF洗滌3次，然后用甲醇洗滌樹脂，以除去氨基酸溶液和DMF，以便手工進(jìn)行茚三酮檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果若樹脂呈現(xiàn)無(wú)色，則說(shuō)明反應(yīng)比較完全。依次調(diào)用程序Method2和Method3，按肽鏈的氨基酸序列依次用FmocTyr(2BrZ)OH、FmocProOH、FmocProOH等重復(fù)以上接肽反應(yīng)，直至最終合成出所需肽鏈。合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，L序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ileeu。
后續(xù)類似物的合成中，表1所列參數(shù)基本不變。BocstatineOH的投料比為2，接肽反應(yīng)時(shí)間為40min，脫保護(hù)基時(shí)間為30min。
    肽鏈的切割將合成肽鏈用切割液［TFA∶TIS(triisopropylsilane)∶H2O=95.0∶2.5∶2.5］在低于20℃的條件下切割，反應(yīng)時(shí)間為2.5h，然后減壓過(guò)濾，收集濾液，用冷乙醚沉淀溶解在切割液中的多肽，4000表1    HS1合成中各氨基酸投料比、接肽反應(yīng)時(shí)間r/min離心3min，真空干燥12h，得線性肽鏈的粗品約1.5g。
    抗原肽肽鏈的環(huán)化將線性多肽粗品1.4g用200ml DMF溶解，依次加入EDC(2eq，0.6g)、BOP(1eq，0.7g)、HOBt(2eq，0.42g)和DIEA(5eq，1.1g)，過(guò)夜環(huán)化。加入EDC可以加速縮合反應(yīng)。蒸干DMF，得環(huán)肽粗品1.35g，粗品用MALDITOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定。
    環(huán)肽粗品的純化將上述環(huán)化粗品肽溶于適量DMSO中(由于此肽的水溶性不好，上樣濃度要嚴(yán)格控制在小于1mg/ml)，上樣樣品用5μm的濾紙過(guò)濾。制備色譜柱為Waters XBridge C18、5μm反相柱；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。采用60min內(nèi)B液由30%～65%的線性梯度洗脫方式，流速為38ml/min。收集純度高于95%的餾分。最后冷凍干燥，得100mg純度大于90%的最終產(chǎn)品。
    分析型HPLC檢測(cè)純度色譜柱為SepaxGPC18反相柱(4.6mm×150mm，5μm，120)；洗脫液：A液為0.1% TFA的水溶液，B液為含0.1% TFA的乙腈水溶液；檢測(cè)波長(zhǎng)220nm。采用20min內(nèi)B液由60%～80%的線性梯度洗脫方式，流速為1.0ml/min。
    MS鑒定激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀檢測(cè)目標(biāo)產(chǎn)物的分子量。
    (2)A1HS1的合成路線與純化與HS1的合成略有不同，在A1HS1的合成中，合成方法主要有以下幾點(diǎn)變化：①樹脂改為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護(hù)；③每連接一個(gè)氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM將肽鏈切割下來(lái)，然后脫保護(hù)、洗滌、活化樹脂，再連下一個(gè)氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來(lái)的切割液為HF，時(shí)間1.2h；④純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：70%～100%；⑤HPLC分析時(shí)B液：61%～81%；⑥合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，Pro，statine，Ile，Ile，Leu。其余同HS1合成。冷凍干燥后得250mg純度大于93%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
    (3)A2HS1的合成路線與純化類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A2HS1合成中：①樹脂為FmocProCTC Resin；②氨基酸為Fmoc保護(hù)；③最后切割液為F液，時(shí)間2.5h；④純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：65%～90%；⑤HPLC分析時(shí)B液：60%～80%；⑥合成順序?yàn)椋篜ro，Ile，Ile，Leu，Pro，Val，Tyr，statine；⑦因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來(lái)，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得268mg純度大于92%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
    (4)A3HS1的合成路線與純化類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A3HS1合成中：①樹脂為FmocValWang Resin；②氨基酸為Fmoc保護(hù)；③切割液為F液，時(shí)間2.5h；④純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：43%～85%；⑤HPLC分析時(shí)B液：50%～70%；⑥合成順序?yàn)椋篤al，Tyr，Pro，Pro，Ile，Ile，Leu，statine；⑦因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來(lái)，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得245mg純度大于98%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高。
    (5)A4HS1的合成路線與純化類似于A1HS1的合成，同HS1的合成相比較，在A4HS1合成中：①樹脂為FmocProMerrifield Resin；②氨基酸為Boc保護(hù)；③每連接一個(gè)氨基酸殘基，要用50% TFA/DCM切割，然后洗滌，再連下一個(gè)氨基酸殘基，最后從樹脂上將肽鏈切割下來(lái)，切割液為HF，時(shí)間1.2h；④純化時(shí)梯度洗脫條件為B液：62%～80%；⑤HPLC分析時(shí)B液：62%～82%；⑥合成順序?yàn)椋篜ro，Val，Tyr，statine，statine，Ile，Ile，Leu；⑦因statine是用Boc保護(hù)，因此在連接statine后，要將肽鏈片段先從樹脂上切割下來(lái)，然后脫保護(hù)、洗滌、樹脂活化，再連下一個(gè)殘基。其余同HS1合成。冷凍干燥后得215mg純度大于90%的最終產(chǎn)品。由于溶解度比HS1好，故收率較高

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