轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸水平檢測流程
瀏覽次數(shù):2420 發(fā)布日期:2014-10-30
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轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測流程介紹
轉(zhuǎn)基因食品問題,一直以來都是充滿爭議的話題;如何科學(xué)正確地檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,成了政府檢測機(jī)構(gòu)及相關(guān)工作者高度關(guān)心的問題。
轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測,就是檢測農(nóng)產(chǎn)品中是否含有外源基因,即檢測啟動子、終止子、標(biāo)記基因、目的基因、外源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度等。就方法而言,又分為基因水平的檢測和蛋白水平的檢測。
轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸水平檢測的流程如下:
第一步:樣本前處理
稱取一定質(zhì)量的樣品,在研缽中研磨或用自動組織勻漿儀處理,得到樣品粉末,同時使組織細(xì)胞破壁、釋放出核酸。
第二步:DNA提取純化
可以采用商業(yè)化DNA提取試劑盒,手動或利用自動核酸提取純化系統(tǒng)制備DNA模板,用于后續(xù)的PCR分析。
第三步:內(nèi)源基因的檢測
對物種內(nèi)源基因的PCR檢測,主要用于驗證DNA模板的提取質(zhì)量;
可采用普通PCR方法將目標(biāo)內(nèi)源基因擴(kuò)增后,通過瓊脂糖凝膠電泳分離,利用凝膠成像設(shè)備觀察分析是否有出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶;
也可通過實時熒光定量PCR方法直接檢測目標(biāo)內(nèi)源基因的有無。
檢測結(jié)果陽性表明從樣品中提取出適宜進(jìn)行檢測的DNA,可以進(jìn)行外源基因檢測,否則應(yīng)重新進(jìn)行DNA提取和純化。
第四步:篩選基因檢測與品系鑒定檢測
對植物中轉(zhuǎn)基因成分的檢測,先篩選檢測CaMV 35S、NOS、NPTII、PAT、BAR基因(啟動子、終止子等等),確定是否含有外源基因;篩選結(jié)果陰性則直接報告結(jié)果;
若篩選結(jié)果陽性,則需要進(jìn)一步鑒定檢測MON810、Bt11、Bt176、T14/T25、CBH351、GA21、TC1507、MON863、NK603、Bt10(結(jié)構(gòu)基因)的結(jié)構(gòu)特異性基因或品系特異性基因以確定是何種轉(zhuǎn)基因品系。
這兩個步驟均可通過普通PCR或者實時熒光定量PCR方法完成。
第五步:確證實驗
如果采用普通PCR方法檢測篩選基因與結(jié)構(gòu)特異性基因或品系特異性基因結(jié)果為陽性,則需要通過采用實時熒光PCR方法進(jìn)行結(jié)果確證實驗。
第六步:結(jié)果判斷與計算
待測樣品外源基因檢測Ct值≥40,內(nèi)源基因檢測Ct值≤24,對照正常,則可判定該樣品未檢出XXX基因;
待測樣品外源基因檢測Ct值≤36,內(nèi)源基因檢測Ct值≤24,對照結(jié)果正常,則可判定該樣品檢出XXX基因;
待測樣品外源基因檢測Ct值在36-40之間,應(yīng)重做實時熒光PCR擴(kuò)增。
定量計算:利用陽性標(biāo)準(zhǔn)品與基因檢測Ct值,可以分別計算出外源基因與內(nèi)源基因序列拷貝數(shù),按照下列公式對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量計算:
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第七步:結(jié)果表述
定性結(jié)果表述:
對于X物種,未檢出轉(zhuǎn)基因成分;
對于X物種,檢出轉(zhuǎn)基因成分,(可進(jìn)一步報告)該樣品中含有XX轉(zhuǎn)基因品系。
定量結(jié)果表述:
未檢出轉(zhuǎn)基因成分,定量方法檢測限為X%;
樣品中XX轉(zhuǎn)基因成分低于本定量方法檢測限(X%);
樣品中所含XX轉(zhuǎn)基因成分為X%。