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western blot實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

瀏覽次數(shù)：1907　發(fā)布日期：2014-8-26　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，其實(shí)發(fā)現(xiàn)WB想要做好并不難，總結(jié)了WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問題，分析了可能的原因及對應(yīng)的解決方案，希望能成為你實(shí)驗(yàn)成功的基石。

問題1：轉(zhuǎn)膜不充分

(1)膜沒有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜。

(2)靶蛋白分子量小于10 000

選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。

(3)靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值

可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液。

(4)甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替。

(5)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時(shí)間。

問題2：背景高

(1)膜沒有完全均勻濕透

使用100% methanol浸透膜。

(2)洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數(shù)。

(3)阻斷不充分

增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。

(3)二抗?jié)舛冗^高

降低二抗?jié)舛取?/DIV>

(4)檢測過程中膜干燥

保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。

(5)曝光過度

縮短曝光時(shí)間。

(6)抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)。

問題3：沒有陽性條帶

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間。

（2）酶失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物。

（3）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低�？煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

（4）試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級檢測系統(tǒng)的有效性。

（5）一抗失效

選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液。

（6）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

問題4：有陽性條帶，但條帶比較弱

（1）抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間。

（2）酶活性降低

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物。

（3）標(biāo)本中靶蛋白含量太低

增加標(biāo)本上樣量。

（4）洗膜過度

縮短洗滌時(shí)間。

（5）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

（6）抗體活性降低

選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置。

（7）封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型。

（8）曝光時(shí)間過短

延長曝光時(shí)間。

（9）HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉。

問題5：條帶位置（大小）不對；或有非特異性條帶

（1）二抗的非特異性結(jié)合

增加一個(gè)對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈的）。

（2）一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性。

（3）蛋白降解

使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑。

（4）二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度。

（5）抗體濃度過高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶。

（6）蛋白上樣量過大

降低上樣量。

問題6：背景有斑點(diǎn)

（1）封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑。

（2）HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體。

問題7：膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶）

（1）HRP含量過高

降低酶聯(lián)二抗的濃度。

北京啟維益成公司授權(quán)代理美國Southern Biotechnology Associates公司，該公司致力于生產(chǎn)、純化、結(jié)合和商業(yè)化世界上最高質(zhì)量的、親和純化的科研用二抗。

http:///cn/brand/2012/1-6/brand_04320701.htm

北京啟維益成公司授權(quán)代理瑞典Agrisera公司，以專注于研發(fā)高品質(zhì)稀有單克隆及多克隆抗體而聞名于業(yè)界，其抗體主要涉及植物蛋白，因此Agrisera作為植物抗體品牌在全球具有較高的知名度，其中包括常用的植物Rubisco抗體。

http:///cn/brand/2012/1-6/brand_95098681.htm

http:///cn/tech/2014/5-26/tech_42699278.htm

http:///cn/cx/2012/3-5/65853752.htm

http:///cn/pro/2012/10-30/pro_36644154.htm

Rubisco小亞基http:///cn/br/Antibodies/04/A160526.htm

Rubisco大亞基http:///cn/br/Antibodies/04/A159184.htm

來源：北京啟維益成科技有限公司試劑部
聯(lián)系電話：010-82743160，82743161,82743162
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