在讀板機上進行基于時間分辨熒光標(biāo)記的Western Blot蛋白檢測和定量

Vanitha Thulasiraman1, Jia-Ren Lin2, Cathy Olsen1, Rainer Muehlbacher3, Brian Quast1,
Michael Katzlinger3, Josef Atzler3, Karlene A. Cimprich2, Evan F. Cromwell1                1Molecular Devices LLC, Sunnyvale, California, USA; 2Department of Chemical & Systems Biology,Stanford University, Stanford, California, USA; 3Molecular Devices GmbH, Salzburg, Austria

摘要

蛋白檢測在制藥和臨床研究領(lǐng)域是一項非常重要的項目，而Western Blot(WB)檢測則是眾多蛋白檢測方法中最常見的一種。目前，檢測轉(zhuǎn)印到WB膜上蛋白的技術(shù)眾多，包括熒光標(biāo)記、銀染和化學(xué)發(fā)光法等�？墒�，每一種技術(shù)都有其局限，人們一直致力于尋找提高WBs定量準(zhǔn)確度和動態(tài)檢測范圍的技術(shù)方法。這里，介紹一種最新的在SpectraMax i3或Paradigm多功能酶標(biāo)儀上檢測WBs膜的蛋白分析方法。膜上使用銪元素-螯合物或鏈霉素標(biāo)
記二抗特異結(jié)合被研究的蛋白。銪元素標(biāo)記具有長熒光壽命周期，可至1ms級別，所以熒光的檢測采用時間分辨的模式，從而可以減少來自于自發(fā)熒光和其他短壽命周期的雜光的背景。WBs膜被置于酶標(biāo)儀內(nèi)，然后使用TRF卡盒進行WBs膜優(yōu)化掃描。此方法不涉及酶的檢測，加之銪元素-螯合物標(biāo)記物具有很強的光漂白抗性，因而信號十分穩(wěn)定能至幾周到幾個月，這就允許對膜進行重復(fù)掃描以及可能進行不同條帶的強度對比以及根據(jù)標(biāo)品進行更精確的定量。TRF檢測方式采用單光子計數(shù)模式，所以理論的動態(tài)檢測范圍為>105。實際應(yīng)用中，動態(tài)檢測范圍則受限于高含量條帶的熒光飽和以及非特異性結(jié)合造成的背景因素。由于不使用CCD不會出現(xiàn)高光溢出現(xiàn)象，而這卻是化學(xué)發(fā)光和普通熒光檢測的常見問題，所以此方法能夠提供非常銳利的條帶和出色的圖像質(zhì)量。這一新穎的多功能酶標(biāo)儀檢測平臺上的Sc a n l a t e r  Western Blot檢測系統(tǒng)以其操作簡便、檢測靈敏和信號的超高穩(wěn)
定性，提供了出色的WBs檢測性能表現(xiàn)，必將給多功能酶標(biāo)儀在實驗室應(yīng)用方面帶來又一重大突破！

原理

ScanLater Western Blot檢測系統(tǒng)簡化了Western Blot的流程，二抗使用銪元素-螯合物標(biāo)記物，掃描在酶標(biāo)儀上進行。不需要底物，膜洗滌后直接進行掃描檢測。銪元素具有長熒光壽命周期，至1ms，檢測模式使用時間分辨模式(TRF)，可以極大減弱自發(fā)熒光和其余短壽命背景雜光。

Figure 1. 上左：蛋白檢測示意圖。二抗直接使用銪元素標(biāo)記。上右：銪元素-螯合物激發(fā)和發(fā)射光譜。下右：TRF檢測模式，銪元素的熒光周期與背景熒光的衰減周期對比，信號的檢測采取一定時間延遲，從而去除背景熒光干擾。

材料與方法

材料
• Scanlater Western Blot試劑盒(10X Washing Buffer, 5X Blocking Buffer, Eu-Labeled Anti-Mouse IgG, Eu-Labeled Anti-Rabbit IgG, Eu-Labeled Streptavidin)，由Molecular Devices, LLC.提供。
• Western Blot膜使用SpectraMax Paradigm或SpectraMax i3 多功能讀板機進行掃描(Molecular Devices)。
• 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST), 生物素化兔抗GST, 鼠抗-GST, 兔抗轉(zhuǎn)鐵蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Abcam)�；瘜W(xué)發(fā)光底物和HRP-二抗(Millipore)。
• TGX 4-20% 膠，雙標(biāo)記蛋白標(biāo)品，電泳緩沖液，上樣緩沖液，轉(zhuǎn)印緩沖液，蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories)， Immobilon FL膜(Millipore)。

方法
• 在200V電壓下，蛋白于TGX 4-20%中，跑膠30min，之后使用Trans Blot Turbo電轉(zhuǎn)印7min到PVDF膜上，然后使用TBST漂洗30s，再用1X封閉液封閉1h。
• 一抗以一定比稀釋比例直接加到封閉液中，室溫下放置2小時或4℃過夜，1X洗液洗膜三次，每次5min。
• 二抗按照1:5000使用1X封閉液進行稀釋，然后加到膜上孵育60min，然后1X洗液洗膜三次，每次5min，最后在去離子水中漂洗15s，晾干準(zhǔn)備進行掃描。
• 在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3多功能讀板機上進行掃描檢測，使用SoftMax® Pro軟件進行分析。

靈敏度和動態(tài)檢測范圍

使用GST進行靈敏度和動態(tài)檢測范圍測試，使用1X上樣液三倍梯度稀釋GST，然后加到4-20%梯度膠中跑膠30min，然后轉(zhuǎn)印到Immobilon FL膜上，使用生物素標(biāo)記的兔抗-GST標(biāo)記2小時，之后與Eu-標(biāo)記的鏈霉素孵育1小時，然后洗膜，晾干使用SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀進行掃描。系統(tǒng)表現(xiàn)出亞-皮克級的檢測靈敏度和>4logs的動態(tài)檢測范圍。

Figure 2. 上圖: SpectraMax Paradigm掃描的GST梯度稀釋標(biāo)品圖像(注：偽彩標(biāo)尺用來顯示大的動態(tài)檢測范圍)；下圖：為每個條帶的總體熒光強度，統(tǒng)計顯示整個動態(tài)檢測范圍為4logs，線性檢測范圍為3logs，圖像分析使用Image J。

信號穩(wěn)定性

銪元素-標(biāo)記的一個最突出的優(yōu)點之一是信號的穩(wěn)定性以及對光漂白的抗性，以致western膜印記條帶的穩(wěn)定性可達(dá)數(shù)月之久。為了顯示這一點，我們將三倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)鐵蛋白進行跑膠(4-20%梯度膠)30min，然后轉(zhuǎn)印Immobilon FL膜上，4℃與兔抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白過夜孵育，然后與銪元素-標(biāo)記的抗兔IgG 4℃孵育1小時，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm分別于當(dāng)天和一個月之后進行掃描。

• 信號經(jīng)過30天也幾乎沒有損失
• 高度可定量結(jié)果

此外，條帶可以進行多次重復(fù)掃描，信號也不會降低，將2倍梯度稀釋的轉(zhuǎn)鐵蛋白跑膠(4-20%梯度膠)30min，然后轉(zhuǎn)印Immobilon FL膜上，與兔抗-轉(zhuǎn)鐵蛋白孵育2小時，然后與銪元素-標(biāo)記的抗兔IgG 4℃孵育1小時，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm進行多次掃描。

應(yīng)用
• 使用Scanlater Western Blot技術(shù)檢測痕量表達(dá)的內(nèi)源性泛素化Rad-18蛋白(參與UV-損傷DNA修復(fù)過程)。

Figure 5. 使用不同濃度(0, 50, 100 ppm)的致癌物MMS(一種烷化劑)處理HEK293細(xì)胞，然后分別使用Scanlater TRF法和化學(xué)發(fā)光法進行檢測和結(jié)果對比(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技術(shù)檢測痕量內(nèi)源性的磷酸化的pChk1(參與UV & MMS-損傷DNA修復(fù)過程)。

Figure 6. 檢測分別使用致癌物MMS和UV輻射處理的HEK-293細(xì)胞中磷酸化的pChk1(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技術(shù)檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程細(xì)胞刺激和抑制過程中產(chǎn)生的痕量內(nèi)源性的磷酸化的JNK1蛋白；

Figure 7. 檢測刺激和抑制后的自然人類肺成纖維細(xì)胞(NHFL)中的磷酸化的JNK1蛋白 (結(jié)果來自試用客戶)。

總結(jié)
• 靈敏度：能夠檢測超低含量的人類細(xì)胞當(dāng)中的內(nèi)源性的磷酸化和泛素化的蛋白；
• 背景消除：銪元素時間分辨熒光標(biāo)記，具有超長熒光壽命，至1ms級，使用TRF檢測模式能夠極大地降低自發(fā)熒光和其他來源的背景噪聲；
• 節(jié)省時間：無需進行ECL般的耗時優(yōu)化過程；
• 降低成本：不再需要成本高昂的X-射線膠片和顯影劑；
• 即插即用：可隨時在SpectraMax i3或SpectraMax Paradigm多功能酶標(biāo)儀上進行高性能WB檢測，極大地擴展了其在實驗室研究方面的應(yīng)用。