Cultex細(xì)胞暴露技術(shù)建立呼吸道過敏反應(yīng)的人肺體外模型
方法簡(jiǎn)介
化學(xué)品引起的呼吸道過敏反應(yīng)，不論是體內(nèi)還是體外，目前尚缺少有效的評(píng)價(jià)方法。因此，新實(shí)驗(yàn)方法的開發(fā)收到極大的關(guān)注，特別是考慮到REACH（《化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制》）新的法規(guī)規(guī)定。應(yīng)注意的是，REACH指導(dǎo)方針明確指出，應(yīng)盡量避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其中，化妝品材料應(yīng)在2013年全面禁止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。所以，建立體外模型顯得非常必須和十分的緊迫。
為了化學(xué)品呼吸道過敏反應(yīng)的人肺體外模型的建立，我們采用Cultex技術(shù)開發(fā)一種三維共培養(yǎng)系統(tǒng)，模擬人肺肺泡區(qū)。該系統(tǒng)，采用細(xì)胞氣液界面暴露技術(shù)，使體外培養(yǎng)的細(xì)胞在完全模擬人肺部環(huán)境下暴露于氣溶膠或顆粒物質(zhì)。
方法
建立三種類型的共培養(yǎng)系統(tǒng)：
雙細(xì)胞共培養(yǎng)模型：
•人肺上皮細(xì)胞（ECs）：A549細(xì)胞
•人肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）：U937細(xì)胞
三細(xì)胞共培養(yǎng)模型，類型1和類型2：
• ECs: A549 cells
• AMs: U937 cells, differentiated to AMs with PMA
• Human immature dendritic cells (DCs): DCs differentiated from human peripheral blood monocytes
ECs種在BD細(xì)胞培養(yǎng)插件上，培養(yǎng)7天。形成上皮細(xì)胞層后，AMs種在ECs層上。對(duì)于三細(xì)胞共培養(yǎng)類型1，DCs培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)插件上（如圖1A）；對(duì)于三細(xì)胞共培養(yǎng)類型2，DC細(xì)胞種在上皮層內(nèi)側(cè)（如圖1B）。
細(xì)胞培養(yǎng)的終點(diǎn)特征：
• EC層完整性：用Millicel-ERS (Millipore)測(cè)量跨上皮電阻（TEER）。
• EC層功能：表面活性蛋白(proSP-C)染色。
• Immature DCs: Staining of DC-marker CD1a and maturation markers CD83/CD86
使用體外暴露染毒系統(tǒng)（Cultex）的共培養(yǎng)模型對(duì)呼吸敏化劑和刺激物進(jìn)行暴露染毒實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果
TEER測(cè)量：電阻值隨著時(shí)間增加。最高值出現(xiàn)在第7天（紅色箭頭），此時(shí)對(duì)插件進(jìn)行處理（圖.2）。
圖 2: 每個(gè)值是3個(gè)腔室內(nèi)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均值。
Staining of surface markers: ECs中表面活性蛋白proSP-C產(chǎn)物，用免疫化學(xué)染色方法所示（圖.3A）。作為陰性對(duì)照，AMs沒有染色陽性proSP-C (圖. 3B)。使用免疫化學(xué)染色方法（圖.3C）和流式方法（圖.3D）分析未成熟的DCs。兩種方法表明，培養(yǎng)的DC具有CD86/CD83陰性表達(dá)。流式表明DC-marker CD1a細(xì)胞呈陽性（圖.3D）。
圖3：免疫細(xì)胞化學(xué)（A-C）和流式（D）的表面標(biāo)記。A，B：ECs（A）和AMs（B）DAPI染色（藍(lán)色信號(hào)）和抗-proSP-C（紅色）。在ECs上檢測(cè)到ProSP-C，但是在AMs上檢測(cè)不到。C：DCs DAPI染色（藍(lán)色信號(hào)）和CD86（紅色）。大部分細(xì)胞CD86呈陰性（箭頭）。 D：DCs流式分析。
討論
以上是采用Cultex體外細(xì)胞暴露技術(shù)建立化學(xué)品呼吸道過敏反應(yīng)的人肺體外模型。這種復(fù)雜三維細(xì)胞共培養(yǎng)體統(tǒng)的使用，我們能夠鑒定生物標(biāo)記物的呼吸道過敏反應(yīng)。由于體外暴露技術(shù)可以直接使用粉末狀顆粒物，不必要求必須具有水溶性特征，所以這一方法可擴(kuò)展適用各種化學(xué)品。
關(guān)于Cultex
Cultex Laboratories GmbH 于2007由Ulrich Mohr教授與Michaela Aufderheide教授為了推進(jìn)其在體外毒理領(lǐng)域的研究而成立。在有關(guān)空氣、揮發(fā)性化合物和復(fù)雜混合物的體外暴露分析方面的最尖端的研究、開發(fā)與實(shí)施方面，兩位創(chuàng)始人都有著出色的業(yè)績(jī)，而且特別注重 “真實(shí)”的暴露環(huán)境。
Cultex專注于體外暴露的毒理研究，擁有CULTEX體外暴露模塊的技術(shù)專利，并根據(jù)研究的進(jìn)展不斷改進(jìn)并優(yōu)化體外暴露實(shí)驗(yàn)設(shè)備及技術(shù)。目前已有CULTEX RFS等模塊投入到各種體外毒理相關(guān)的科研項(xiàng)目之中。依托側(cè)重于吸入毒理的體外毒理學(xué)新技術(shù)的發(fā)展，Cultex亦為其客戶提供全面的服務(wù)，范圍涵蓋咨詢、規(guī)劃和實(shí)施。
Cultex細(xì)胞暴露技術(shù)三層結(jié)構(gòu) 最先進(jìn)的Cultex RFS細(xì)胞暴露模塊
關(guān)于佰樂良成科技
北京佰樂良成科技有限公司自2010年成立于北京，是一家專注于毒理學(xué)研究領(lǐng)域的高科技企業(yè)，主要致力于向用戶提供國際領(lǐng)先的毒理學(xué)研究設(shè)備，以及暴露染毒、毒理分析、毒性評(píng)估等一系列整體解決方案的服務(wù)。目前，北京佰樂良成科技有限公司已成為國內(nèi)最專業(yè)的毒理儀器設(shè)備與整體方案供應(yīng)商。
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