hERG 鉀離子通道高通量安全性篩選

    ——IonWorks Barracuda高通量全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)多次加樣檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)

特點(diǎn)：
• 超高通量——可以滿足大批量化合物篩選的需求
• 每小時(shí)> 6,000數(shù)據(jù)點(diǎn)
• 384通道同時(shí)記錄
• 超低的運(yùn)行成本
•  穩(wěn)定、可靠的設(shè)備
•  低廉、高效的耗材
• 每孔連續(xù)加樣方法記錄得到的濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)結(jié)果類(lèi)似于傳統(tǒng)手動(dòng)膜片鉗記錄結(jié)果
• 高一致性、可重復(fù)的數(shù)據(jù),
•  專利的Population Patch Clamp 技術(shù)保證了高度可重復(fù)性記錄

由于hERG (人 ether-à-go-go基因)被抑制后潛在的致死風(fēng)險(xiǎn)，愈發(fā)凸顯了在藥物研發(fā)早期階段開(kāi)展候選藥物hERG安全性篩選的重要性。因其運(yùn)行高成本、低通量及對(duì)操作人員的高要求，作為研究離子通道活性的和藥理學(xué)特性金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)對(duì)于大批量的篩選需求來(lái)說(shuō)明顯不切實(shí)際。即使經(jīng)過(guò)過(guò)去十多年全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)的快速發(fā)展，高成本和通量相對(duì)較低的因素任然限制了hERG離子通道的安全性篩選。

IonWorks Barracuda® 全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)為制藥和生物技術(shù)企業(yè)提供了真正的解決方案，低成本、快速、高效地對(duì)數(shù)以千計(jì)的化合物進(jìn)行hERG離子通道安全性篩選。384道平行記錄的性能以及低廉的耗材使得IonWorks Barracuda成為中、高通量大批量化合物篩選的理想設(shè)備。

每孔多次加樣的方法帶來(lái)的特點(diǎn)之一是所記錄的量效數(shù)據(jù)類(lèi)似于傳統(tǒng)手動(dòng)膜片鉗記錄的數(shù)據(jù)，這樣所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)質(zhì)量更可靠。這種方法可廣泛用于多種離子通道的研究中，特別是觀察電壓門(mén)控離子通道的化合物阻斷效應(yīng)的研究。

研究目的

采用每孔多次加樣的方法可以增加通量并節(jié)省化合物篩選成本。本研究旨在評(píng)估在IonWorks Barracuda系統(tǒng)中進(jìn)行hERG化合物安全性篩選中使用加樣方法的效果，并與Barracuda中另一種整板每孔單點(diǎn)加樣的方法進(jìn)行比較。

IonWorks Barracuda系統(tǒng)支持每個(gè)刺激方案下最多８次加樣，且一次實(shí)驗(yàn)中刺激方案的次數(shù)不限，從而在實(shí)際上來(lái)說(shuō)每次實(shí)驗(yàn)的加樣次數(shù)是沒(méi)有限制的。

檢測(cè)化合物濃度效應(yīng)的藥理學(xué)特性時(shí)，在整個(gè)384孔記錄板的每一個(gè)記錄孔中可以采用從低濃度至高濃度的多次累積加樣方法。這種單孔重復(fù)多次加樣的方法有一下幾方面優(yōu)勢(shì)：

• 增加通量
• 降低成本
• 與傳統(tǒng)檢測(cè)化合物作用于離子通道效應(yīng)的方法一致，每個(gè)細(xì)胞或記錄位點(diǎn)加入化合物的多個(gè)濃度并檢測(cè)其連續(xù)的梯度濃度效應(yīng)。

典型的單孔８次加樣實(shí)驗(yàn)需要大約30分鐘，產(chǎn)生>3000數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而每小時(shí)可以得到>6000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

IonWorks Barracuda系統(tǒng)篩選hERG安全性化合物時(shí)也可以采用另外一種整板加樣且每孔只加樣一次的方式。

在此方法下，大約每20分鐘 完成一次384個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的采集，從而每小時(shí)可以得到>1100個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
為了有效的比較上述兩種加樣方法的藥理學(xué)數(shù)據(jù)，本次實(shí)驗(yàn)使用了完全一致的hERG 陽(yáng)性抑制劑，并采用６個(gè)濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果

比較化合物多濃度效應(yīng)的藥理學(xué)特性時(shí)，單孔多次加樣方法比整板單次加樣增加了超過(guò)４倍的通量。

７個(gè)hERG通道的陽(yáng)性抑制劑在每個(gè)記錄孔中連續(xù)添加６個(gè)梯度濃度。兩種加樣方法結(jié)果（單次加樣和多次加樣）的比較見(jiàn)表１。通量每次實(shí)驗(yàn)增加至2300個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，每小時(shí)為4600個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。

材料和方法

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人Kv11.1 通道的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)來(lái)自ChanTest 公司(Cleveland, OH)。本實(shí)驗(yàn)中所使用的所有試劑和藥品均來(lái)自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO).

hERG 離子通道多次加樣方法的開(kāi)發(fā)

多次加樣的方法中細(xì)胞需要進(jìn)行多次的溶液交換并且電壓刺激時(shí)間延長(zhǎng)，從而增加了電流rundown 的可能性。為提高試驗(yàn)時(shí)間加長(zhǎng)后細(xì)胞記錄的穩(wěn)定性，使用單次脈沖電壓刺激方案代替原來(lái)單次加樣方法中的５次脈沖電壓刺激方案。化合物溶于細(xì)胞外液中，濃度為3 倍終濃度，含有1% DMSO。

化合物溶于細(xì)胞外液中，濃度為3 倍終濃度，含有1% DMSO。實(shí)驗(yàn)時(shí)加入記錄孔后被稀釋至最終濃度，DMSO 的濃度為0.33% 。化合物加入記錄孔后孵育一分鐘后開(kāi)始給予電壓刺激，+40 mV 持續(xù)一秒，然后再施加-50 mV 刺激一秒，用以檢測(cè)尾電流峰值（圖1）。一次實(shí)驗(yàn)需要準(zhǔn)備6 個(gè)不同濃度梯度的化合物板，便于加樣頭完成6 次加樣。完整的實(shí)驗(yàn)方法確認(rèn)后，依次檢測(cè)選定的7 個(gè)hERG 陽(yáng)性藥物。

多次加樣實(shí)驗(yàn)的記錄穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖2。圖中分別展示了其中一次實(shí)驗(yàn)所有384 孔的平均封接電阻值，以及24 個(gè)
對(duì)照孔0.33% DMSO 外液6 次加樣后得到的尾電流峰值為基準(zhǔn)的平均通道激活程度。

單孔多次加樣方法的藥理學(xué)特性：產(chǎn)生的累積濃度效應(yīng)數(shù)據(jù)類(lèi)似于傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)方法

在7 個(gè)hERG 陽(yáng)性藥物藥理學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，每次實(shí)驗(yàn)需要連續(xù)監(jiān)測(cè)6 塊化合物板。每個(gè)化合物板只有每個(gè)待檢
測(cè)化合物的一個(gè)濃度，每個(gè)化合物重復(fù)24 個(gè)孔。第一塊化合物板的濃度最低，第六塊化合物板的濃度最高。