呼吸道合胞病毒(RSV)是人類上呼吸道感染(URI)最重要的感染病原之一，尤其是兒童。RSV大約引起兒童90％的支氣管炎，幾乎所有嬰幼兒在生后頭3年都感染過(guò)RSV[1]。因此，進(jìn)行RSV感染引起咳嗽的研究具有重要意義。目前認(rèn)為，咳嗽反射敏感性(CRS)異常增高是機(jī)體咳嗽反應(yīng)的一個(gè)十分重要的原因。O’Connell等L21的臨床研究發(fā)現(xiàn)，URI引起的咳嗽患者CRS升高是其主要特征，并不伴氣道反應(yīng)性(AR)增高。但是，迄今為止，有關(guān)感染后咳嗽的真正機(jī)制知之甚少，還未見(jiàn)到RSV感染引起咳嗽的動(dòng)物研究，病毒感染往往伴發(fā)AR升高，那么AR是否在感染后咳嗽中起關(guān)鍵作用呢?

    辣椒素受體亞型1(vanilloid receptor-1，VRl)是瞬時(shí)受體電位通道蛋白的超家族的成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)慢性咳嗽患者VRl顯著高于健康者；而且，CRS與支氣管黏膜的VRl表達(dá)呈高度相關(guān)；氣道平滑肌VRl的表達(dá)也增強(qiáng)。表明VRl參與了慢性咳嗽的發(fā)病過(guò)程[3]，但病毒感染后VRl如何改變目前還缺乏研究。有研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染可以引起標(biāo)記呼吸道總神經(jīng)纖維分布的蛋白基因產(chǎn)物9．5(protein gene product一9．5，PGP一9．5)的分布及表達(dá)

水平改變[4]。本研究將通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察與咳嗽有關(guān)的CRS、AR、VRl和PGP一9．5蛋白的變化，探討RSV引起咳嗽，尤其是感染后咳嗽的發(fā)病機(jī)制。

1材料與方法

1．1

主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑    胎牛血清及MEM、DMEM／F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，辣椒素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，VRl鼠抗單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。HRP標(biāo)記免疫組化二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。單腔非限制型小動(dòng)物體描儀購(gòu)自美國(guó)Buxco公司，Leica DM4000智能型生物顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1．2細(xì)胞培養(yǎng)和RSV的培養(yǎng)、收獲及定量    人喉癌上皮細(xì)胞株(Hep一2)和RSV病毒株均來(lái)源于美國(guó)ATCC，Hep一2細(xì)胞是對(duì)RSV敏感的細(xì)胞，用于病毒株的傳代培養(yǎng)。當(dāng)Hep一2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至70％～80％融合后，取病毒懸液接種于細(xì)胞上，每15分鐘搖動(dòng)1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入2％胎牛血清的培養(yǎng)基，于第2～3天開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變，待病變達(dá)50％～60％時(shí)收獲病毒，將細(xì)胞反復(fù)凍融2～3次后lO000 r／min，4℃，離心20 min，去除細(xì)胞碎片，收集上清分裝后液氮中凍存�？瞻呒夹g(shù)測(cè)定病毒感染滴度，以空斑形成單位(pfu)來(lái)表示病毒感染滴度。

1．3動(dòng)物分組、飼養(yǎng)、病毒接種和哮喘模型制作    雄性純白SPF級(jí)豚鼠來(lái)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250～300 g。隨機(jī)分成5組，即正常對(duì)照組和4個(gè)病毒感染組。病毒感染組按病毒感染后天數(shù)又分為感染后6、12、28和42 d四個(gè)組。每組10只。SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，感染組動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)，在適應(yīng)新的環(huán)境1周左右后開(kāi)始接種病毒。病毒滴鼻：乙醚麻醉后，兩側(cè)鼻孔分別滴入75“l的事先擴(kuò)增凍存好的病毒液，病毒滴度為3．72×105 pfu。哮喘模型制作：腹腔內(nèi)注射含5％雞卵自蛋白和10 g／L氫氧化鋁混合液1 m1致敏，15 d后予卵白蛋白吸人誘發(fā)哮喘發(fā)作。

1．4豚鼠CRS的測(cè)定通過(guò)辣椒素咳嗽激發(fā)試驗(yàn)判斷氣道的CRS。其原理是通過(guò)霧化吸入特異性的刺激物，激活氣道感覺(jué)神經(jīng)末梢的咳嗽感受器，誘發(fā)咳嗽的產(chǎn)生，以激發(fā)物的濃度和咳嗽程度判斷CRS。辣椒素是紅辣椒的刺激成分提取物，因?yàn)槠浒踩�、劑量依賴性和可重�?fù)性好，所以很適合用作CRS的評(píng)價(jià)。用單腔非限制型小動(dòng)物體描儀測(cè)定豚鼠的CRS，各組動(dòng)物分別在預(yù)定時(shí)間進(jìn)行辣椒素咳嗽激發(fā)試驗(yàn)，判斷CRS的指標(biāo)主要是咳嗽總次數(shù)(CCnt)，方法參照Lewis等口1的研究所描述的。辣椒素激發(fā)溶液濃度為50弘mol／L，總量為1 ml，觀測(cè)記錄10 min(含霧化時(shí)間)內(nèi)的CCnt。

1．5

豚鼠氣道高反應(yīng)性(AHR)的測(cè)定     CRS測(cè)定后12 h，用Buxco無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)豚鼠的增強(qiáng)呼氣間歇(enhanced pause，Penh)。測(cè)定100弘l倍增濃度的乙酰甲膽堿(MeCh)霧化激發(fā)后Penh的變化，激發(fā)濃度由低到高，依次為100、200、400、800、1 600 mg／L，記錄各濃度級(jí)MeCh激發(fā)下的Penh平均值。將每個(gè)MeCh激發(fā)濃度下的Penh值轉(zhuǎn)換為與生理鹽水激發(fā)時(shí)Penh值的百分比，以Penh％表示，作為AHR的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1．6

Real—time PCR方法檢測(cè)肺組織VRl的mRNA相對(duì)表達(dá)    Primer5．o設(shè)計(jì)的RSV引物序

列如下：VRl正義引物：5’一TCAAAGACCC—GGAAACAGGG一3’，反義引物：5’一CTCTACCA—GGAGGGTCACCA一3’，產(chǎn)物224 bp；GAPDH(內(nèi)參照)正義引物：57一TGGTGCCAAAAGGGTCA一3’，反義引物：5’一CCTCCACAATGCCGAAGT一3’，產(chǎn)

物176 bp。提取組織總RNA。采用2一心、相對(duì)定量法來(lái)計(jì)算VRl mRNA的表達(dá)水平。

1．7免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)豚鼠肺組織VRl和PGP．9．5蛋白的表達(dá)及免疫組化結(jié)果圖象分析(半定量方法)

DAB染色免疫組化圖片用Leica顯微鏡觀察、拍照，進(jìn)行蛋白表達(dá)強(qiáng)度(灰度)的比較。根據(jù)以下染色深淺行半定量分析：0=無(wú)染色；1一輕度著色；2一中度著色；3一強(qiáng)著色；4一很強(qiáng)著色(幾乎呈黑色)。每張片子至少隨機(jī)分析5個(gè)高倍視野。所有片子均由2個(gè)不知情的人分析。

1．8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    采用SPSS 16．o統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以z±s表示。因樣本數(shù)不多，標(biāo)準(zhǔn)差偏大，各組間總體檢驗(yàn)采用非參數(shù)經(jīng)驗(yàn)Kruskal—Wallis法，組間比較采用Bonferroni的組問(wèn)比較檢驗(yàn)法。P<o．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2

結(jié)果

2．1

豚鼠CRS測(cè)定結(jié)果感染后6、12、28和42 d組豚鼠CRS分別為：(8．oo±3．86)、(8．70±6．20)、(7．60±4．40)和(6．70土3．71)CCnt，均較正常對(duì)照組[(2．50±1．43)CCnt]升高(P<o．05)，以感染后12 d組升高最為明顯(P<0．01)；而哮喘組CRS為(3．90土1．60)CCnt，與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2豚鼠AR的改變

圖1結(jié)果顯示，急性感染后12 d組豚鼠AR對(duì)2個(gè)高濃度MeCh刺激結(jié)果是(1 069土156)％和(1 846±285)％，均高于正常對(duì)照組(P值分別<0．05和o．01)。雖然其他感染組部分豚鼠AR也有一些不同程度的增高，尤其是第28天組，但由于個(gè)體差異大，整體與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而哮喘組豚鼠與正常對(duì)照組相比均有明顯AHR。

注：哮喘組與正常對(duì)照組比較。aP<0．05，6P<0．01；感染后12 d組與正常對(duì)照組比較，cP<0．05。6P<0．01

圖l

呼吸道合胞病毒實(shí)驗(yàn)豚鼠氣道高反應(yīng)性的改變(H一8)

2．3

Real—time PCR方法檢測(cè)肺組織VRl mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果表1顯示RSV感染后6、12和28 d組VRlmRNA表達(dá)分別為：1．57士O．43、1．61±0．47和1．68±o．56，均高于正常對(duì)照組(P值均<O．05)，而以感染后28 d組為最高。

2．4

VRl和PGP一9．5蛋白的免疫組織化學(xué)結(jié)果見(jiàn)圖2及表2(單位以灰度表示)。與正常對(duì)照組相比，病毒感染組豚鼠肺組織可見(jiàn)深黃色陽(yáng)性反應(yīng)物。表達(dá)強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng)顆粒顏色較深，陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量也顯著多于正常對(duì)照組。感染后28 d組VRl表達(dá)為2．14(1．00)，較正

注：VRl：辣椒素受體亞型1；A：完全正常的免疫組化結(jié)果；B：VRl強(qiáng)表達(dá)；C：PGP-9．5強(qiáng)表達(dá)

圖2    VRl和PGP一9．5蛋白的免疫組化結(jié)果DAB染色×400

常對(duì)照組[1．14(o．oo)]增強(qiáng)(P<0．05)。感染后12 d組PGP一9．5表達(dá)為2．29(1．00)，較正常對(duì)照組增強(qiáng)(P<O．05)。

3討論

    眾所周知，病毒感染引起的咳嗽是急性咳嗽的最常見(jiàn)原因，而病毒感染后咳嗽一般為亞急性咳嗽，時(shí)間為3～8周，在亞急性咳嗽中占絕大多數(shù)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了感染后6、12、28和42 d作為觀察時(shí)間點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)所有感染組豚鼠的CRS均較對(duì)照組明顯升高，亞急性階段甚至還高于急性咳嗽階段。因此，本研究的特點(diǎn)類似0’Connell等比研究中的臨床呼吸道感染咳嗽患者，說(shuō)明CRS的升高可能是病毒感染引起咳嗽的主要特點(diǎn)。病毒感染導(dǎo)致了機(jī)體的咳嗽反應(yīng)增加的機(jī)制涉及到病毒引起的氣道炎癥，改變了控制氣道的傳入和傳出神經(jīng)，最終引起持續(xù)的咳嗽；或者是因?yàn)檠装Y介質(zhì)引起咳嗽有關(guān)的感受器致敏。

    哮喘也是咳嗽的一個(gè)常見(jiàn)原因，咳嗽可以作為典型哮喘的前身或作為其單獨(dú)的主要癥狀，即我們所熟悉的咳嗽變異性哮喘(CVA)。CVA同感染后咳嗽很相似，但是它們存在2種完全不同的機(jī)制，CVA是由于氣道平滑肌的痙攣引起，對(duì)支氣管擴(kuò)張劑敏感，而CRS正常L”⋯。而后者正如O7Connell等心1的研究發(fā)現(xiàn)的，則是因?yàn)?/FONT>CRS的升高。因?yàn)槎鄶?shù)這些臨床患者可以提供URI的病史，說(shuō)明有可能是他們的咳嗽感受器在URI后變得持續(xù)敏感。因此，URI可能是通過(guò)引起辣椒素敏感的氣道傳入神經(jīng)的敏感性增加而引起感染后咳嗽，伴或不伴氣道直徑或反應(yīng)性的變化。