雙室體描儀測(cè)定豚鼠氣道阻力和氣道反應(yīng)性
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摘要：目的 建立應(yīng)用雙室體描儀測(cè)定豚鼠氣道阻力和氣道反應(yīng)性的方法，為哮喘的研究提供有效手段。方法 應(yīng)用雙室體描儀分別測(cè)定乙酰甲膽堿(Mch)激發(fā)后豚鼠氣道阻力的回復(fù)時(shí)間；于實(shí)驗(yàn)的第1、15天分別測(cè)定正常對(duì)照組豚鼠氣道阻力和氣道反應(yīng)性2次，每次間隔2h，驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性；觀察OVA致敏豚鼠OVA激發(fā)前后氣道阻力和氣道反應(yīng)性的變化情況。結(jié)果 PC100濃度的Mch霧化后，豚鼠在1h內(nèi)氣道阻力回到基線水平。正常對(duì)照組豚鼠在第1、15天分別測(cè)量?jī)纱蔚幕A(chǔ)氣道阻力sRaw為(3.25±0.67) cmH2O·s、(3.33±0.58)cmH2O·s、(3.30±0.56) cmH2O·s、(3.32±0.75) cmH2O·s，氣道反應(yīng)性(log2PC100)值分別為8.48±0.94、8.64±1.04、8.56±0.67、8.64±0.60，氣道阻力和氣道反應(yīng)性兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。致敏豚鼠OVA激發(fā)后氣道阻力和氣道反應(yīng)性均較激發(fā)前顯著提高，sRaw分別為(7.08±1.82) cmH2O·s和(2.87±0.53) cmH2O·s(P<0.01)，log2PC100值分別為6.64±1.26和8.48±1.17(P<0.01)。結(jié)論 成功建立了應(yīng)用雙室體積描記法測(cè)定豚鼠氣道阻力和氣道反應(yīng)性的實(shí)驗(yàn)方法。
關(guān)鍵詞：體描儀；氣道阻力；氣道反應(yīng)性；豚鼠
豚鼠容易致敏，能產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，是最常用的構(gòu)建哮喘模型的動(dòng)物之一。但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)所構(gòu)建的豚鼠哮喘模型往往缺少氣道反應(yīng)性等呼吸生理指標(biāo)，嚴(yán)格來說，只能算是豚鼠變應(yīng)性氣道炎癥模型。氣道高反應(yīng)性(AHR)是支氣管哮喘的基本特征之一，要闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制，必然要研究AHR的機(jī)制。本研究在國(guó)內(nèi)率先應(yīng)用雙室體描儀測(cè)定豚鼠的氣道阻力和氣道反應(yīng)性，旨在建立一種簡(jiǎn)便的可重復(fù)的測(cè)定氣道反應(yīng)性的方法，為哮喘的研究提供有效的手段。
1 材料和方法
1.1 材料
乙酰甲膽堿(Methacholine，Mch)、雞卵白蛋白(OVA)、氫氧化鋁購(gòu)自Sigma公司；鹽酸苯海拉明(天津藥業(yè)集團(tuán))；便攜式超聲波霧化吸入器(粵華儀器廠)；雙室體描儀(美國(guó)BUXCO公司)；微量超聲霧化器(美國(guó)Aerogen公司)。
1.2 動(dòng)物及分組
普通級(jí)純白Hartly豚鼠26只，體質(zhì)量(400±50) g，雄性，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為3組。正常對(duì)照組A：8只豚鼠，應(yīng)用系列濃度Mch霧化豚鼠直至PC100(霧化某一濃度的Mch后，氣道阻力較基礎(chǔ)氣道阻力上升100%或以上，即停止霧化Mch，該濃度即為PC100)，然后觀察氣道阻力回復(fù)至基線水平所用時(shí)間。正常對(duì)照組B：12只豚鼠，在第1、15天各分別兩次測(cè)豚鼠的氣道阻力和氣道反應(yīng)性，每次間隔2 h。哮喘組C：6只豚鼠，致敏后在OVA激發(fā)前和激發(fā)后分別測(cè)定氣道阻力和氣道反應(yīng)性各1次，時(shí)間間隔2 h。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 制作哮喘模型 哮喘模型的制作參照文獻(xiàn)[1]并略作改動(dòng)。哮喘組豚鼠于實(shí)驗(yàn)第l天腹腔內(nèi)注射含5% OVA和10 mg/ml氫氧化鋁的生理鹽水混合液1 ml致敏，實(shí)驗(yàn)第15天置豚鼠于一35 cm×26 cm×31 cm的塑料箱中，便攜式超聲波霧化吸入器霧化吸入1% OVA生理鹽水溶液2 min，以誘發(fā)豚鼠哮喘發(fā)作，霧化速度為1.3 ml/min。霧化誘喘前10 min豚鼠按4 mg/kg腹腔注射鹽酸苯海拉明，以抑制可能發(fā)生的超敏反應(yīng)。
1.3.2 氣道阻力和氣道反應(yīng)性的測(cè)定方法 雙室體描儀由頭室和體室組成，各置一流量傳感器，分別用于測(cè)量鼻部呼吸引起的氣流變化和胸廓運(yùn)動(dòng)引起的氣流變化。流量傳感器感受到的流量變化轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，經(jīng)放大器放大，轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)后，通過軟件(BioSystem XA software with NAM analyzer)分析，計(jì)算出豚鼠氣道阻力(specific airway resistance，sRaw)。豚鼠頸部套上3個(gè)大小適中的橡膠項(xiàng)墊，起到固定豚鼠及保持兩室之間相對(duì)密閉的作用。置豚鼠于體描儀中，等豚鼠安靜5 min后，動(dòng)態(tài)測(cè)定sRaw。依次用微量超聲霧化器霧化生理鹽水、25、50、100、200、400、800、1600 mg/L Mch 30 s，霧化速度為0.2 ml/min，霧化完30 s后監(jiān)測(cè)sRaw 2 min。若sRaw上升較基礎(chǔ)sRaw上升小于100%，即霧化下一濃度。當(dāng)霧化某一濃度的Mch后，sRaw較基礎(chǔ)sRaw上升100%或以上，確定這一Mch濃度為PC100。此時(shí)即停止霧化Mch。某豚鼠的PC100值越大，證明此豚鼠的氣道反應(yīng)性越低。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各豚鼠所測(cè)得的PC100值進(jìn)行log2數(shù)值變換。各指標(biāo)(計(jì)量資料)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性檢驗(yàn)用單因素方差分析。組間比較用LSD(方差齊時(shí))或Tamhane's T2(方差不齊時(shí))；OVA致敏豚鼠OVA激發(fā)前后氣道阻力和氣道反應(yīng)性的比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
正常對(duì)照組豚鼠呼吸波平順，致敏豚鼠OVA激發(fā)前呼吸波和正常對(duì)照組豚鼠呼吸波形態(tài)上無明顯區(qū)別；致敏豚鼠OVA激發(fā)后呼吸波高尖，頻率加快，氣道阻力增大。見圖1、2。
圖1 致敏豚鼠OVA激發(fā)前呼吸波
Fig.1 Rspiratory wave of sensitized guinea pigs before OVA challenge
圖2 致敏豚鼠OVA激發(fā)后呼吸波
Fig.2 Respiratory wave of sensitized guinea pigs after OVA challenge
2.2 Mch激發(fā)豚鼠后sRaw回復(fù)至基礎(chǔ)水平所要時(shí)間
應(yīng)用PC100濃度的Mch霧化豚鼠，豚鼠的sRaw較基礎(chǔ)阻力上升1倍后，部分豚鼠的sRaw仍可繼續(xù)上升，4 min后阻力逐步回落，一般30 min內(nèi)可以回落至基礎(chǔ)值水平，6號(hào)豚鼠6 min氣道阻力即回落至基礎(chǔ)水平，但4號(hào)豚鼠1 h后氣道阻力才回落至基礎(chǔ)水平。
2.3 雙室體描儀測(cè)量豚鼠sRaw和氣道反應(yīng)性測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性
正常對(duì)照組B豚鼠在第1、15天分別測(cè)量?jī)纱位A(chǔ)氣道阻力sRaw為(3.25±0.67) cmH2O·s、(3.33±0.58) cmH2O·s、(3.30±0.56) cmH2O·s、(3.32±0.75) cmH2O·s，4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量的氣道阻力兩兩比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。相對(duì)應(yīng)測(cè)量豚鼠的4次的氣道反應(yīng)性(log2PC100)值分別為8.48±0.94、 8.64±1.04、 8.56±0.67、 8.64±0.60，其值兩兩比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此說明應(yīng)用雙室體描儀測(cè)量豚鼠sRaw和氣道反應(yīng)性的重復(fù)性良好，可對(duì)豚鼠進(jìn)行這兩項(xiàng)指標(biāo)的動(dòng)態(tài)多次檢測(cè)。
2.4 驗(yàn)證豚鼠的哮喘模型
哮喘模型組豚鼠OVA激發(fā)前后sRaw分別為(2.87±0.53) cmH2O·s和(7.08±1.82) cmH2O·s(P<0.01)，說明豚鼠OVA激發(fā)后氣道阻力高于OVA激發(fā)前氣道阻力。OVA激發(fā)前后log2PC100值分別為8.48±1.17和6.64±1.26(P<0.01)，說明豚鼠OVA激發(fā)后氣道反應(yīng)性高于OVA激發(fā)前。從呼吸生理的角度看，應(yīng)用雙室體描儀測(cè)定sRaw和氣道反應(yīng)性，能有效地驗(yàn)證豚鼠的哮喘模型。
3 討論
豚鼠容易致敏，能產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，特別適合于制作過敏性哮喘動(dòng)物模型。但國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)所構(gòu)建的豚鼠哮喘模型往往缺少呼吸生理的功能指標(biāo)，嚴(yán)格來說，只能算是豚鼠變應(yīng)性氣道炎癥模型。所以有必要對(duì)這種“變應(yīng)性氣道炎癥”進(jìn)行肺功能的測(cè)定以證實(shí)哮喘模型的構(gòu)建成功。同時(shí)這種呼吸生理功能的測(cè)定，利于觀察藥物等干預(yù)手段的效果，利于對(duì)哮喘發(fā)病及診療機(jī)制的探討。本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)內(nèi)首次購(gòu)進(jìn)美國(guó)BUXCO公司的雙室體描儀對(duì)豚鼠的sRaw和氣道反應(yīng)性進(jìn)行了測(cè)定。雙室體積描記系統(tǒng)包括體積描記箱(Plethysmograph)、超聲霧化器(Ultrasonic Nebulizer)及霧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)、前置信號(hào)放大器(MAXII preamplifier unit)、信號(hào)處理系統(tǒng)(BioSystem XA for Windows software)等幾部分。體積描記箱由頭室(用于測(cè)量鼻部氣流的變化)和體室(用于測(cè)量胸腔氣流的變化)構(gòu)成，每一室均連接一個(gè)流量傳感器以測(cè)定室內(nèi)的呼吸流量變化。其工作原理是根據(jù)鼻腔比胸腔的氣流滯后時(shí)間dT來計(jì)算氣道阻力sRaw。由于先有胸廓的運(yùn)動(dòng)才會(huì)產(chǎn)生氣體進(jìn)出體內(nèi)的過程，鼻部的氣流滯后于胸部的氣流產(chǎn)生時(shí)差dT，當(dāng)sRaw增加時(shí)，鼻部氣流與胸部氣流的相位差會(huì)增加。根據(jù)公式：sRaw=[(TI+TE)/(2π)×(Patm-47)×1.36×2π×dT/(TI+TE)](公式中Patm代表大氣壓，TI代表吸氣時(shí)間，TE代表呼氣時(shí)間)，通過軟件(BioSystem XA software with NAM analyzer)分析，可以計(jì)算出sRaw，從而了解動(dòng)物的氣道阻力情況。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)顯示，PC100濃度的Mch霧化豚鼠后，豚鼠的sRaw在幾分鐘內(nèi)仍可上升，在1 h內(nèi)阻力回到基線水平。要排除測(cè)定中應(yīng)用Mch激發(fā)會(huì)對(duì)下一次sRaw的測(cè)定造成影響，兩次測(cè)定sRaw的時(shí)間間隔應(yīng)該在1 h以上，所以為了驗(yàn)證雙室體描儀測(cè)量豚鼠sRaw和氣道反應(yīng)性測(cè)量的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)第1、15天重復(fù)測(cè)定正常對(duì)照組豚鼠各1次，同一天的測(cè)量時(shí)間間隔選取為2 h。結(jié)果顯示各次的氣道基礎(chǔ)阻力和氣道反應(yīng)性無明顯差異，證明應(yīng)用雙室體積描記法測(cè)定豚鼠的氣道基礎(chǔ)阻力和氣道反應(yīng)性的重復(fù)性良好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OVA致敏豚鼠激發(fā)后sRaw和氣道反應(yīng)性較激發(fā)前均顯著提高，證明OVA致敏及激發(fā)豚鼠是簡(jiǎn)單有效的構(gòu)建哮喘模型的方法，雙室體積描記法的應(yīng)用為哮喘研究提供了有效的手段。
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