本文以人EGFR抗體與細(xì)胞表面EGFR抗原結(jié)合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應(yīng)用。EGFR配體的蛋白家族參與了細(xì)胞遷移，粘附和分化等活動(dòng)，包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌在內(nèi)的許多疾病都和EGFR的過(guò)度表達(dá)有著密切的關(guān)系。

    不同靶蛋白的單克隆抗體的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，可以用于不同疾病的治療和診斷（譬如癌癥，自身免疫性疾�。�。單克隆抗體是特定細(xì)胞系針對(duì)特定抗原的分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的生物蛋白，而高通量篩選是抗體開(kāi)發(fā)的重要組成部分。

ELISA和Mix-and-read

    利用傳統(tǒng)ELISA技術(shù)在進(jìn)行抗體篩選時(shí)有許多局限性，由于ELISA技術(shù)依賴于微孔板上包被的抗原，所以該方法不適合檢測(cè)低溶解性的抗原（譬如細(xì)胞表面受體）。由于ELISA的操作方式，使得ELISA很難進(jìn)行識(shí)別細(xì)胞表面抗原天然構(gòu)象的抗體的篩選。即使對(duì)于可溶性抗原抗體篩選，由于微孔板對(duì)檢測(cè)抗體的吸附從而改變蛋白構(gòu)象，繼而無(wú)法識(shí)別抗原特定抗原表位。

    一種“mix-and-read”分析方法在生物制藥行業(yè)的單克隆抗體篩選領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。這種”mix-and-read”分析方法是將所有分析組分加到一個(gè)孔中，繼而孵育從而使得結(jié)合達(dá)到平衡。對(duì)于抗體篩選，該方法可以利用包被抗原的珠子或者表達(dá)抗原的細(xì)胞進(jìn)行分析，抗原抗體的相互作用可以通過(guò)結(jié)合在珠子或者細(xì)胞的熒光標(biāo)記的偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)合的熒光可以利用細(xì)胞技術(shù)儀無(wú)需洗滌進(jìn)行分析，以達(dá)到區(qū)分測(cè)試孔中結(jié)合和游離的熒光。Lee等在發(fā)明FMAT時(shí)，詳細(xì)介紹了相比傳統(tǒng)ELISA方法細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的優(yōu)勢(shì)。相對(duì)于傳統(tǒng)的ELISA分析方法，利用該技術(shù)分析“mix-and-read”實(shí)驗(yàn)可以提高檢測(cè)的靈敏度和分析的通量，同時(shí)也提高抗體的識(shí)別和檢測(cè)。

高速的多重分析

    TTP LabTech的mirrorball非常適合這種“mix-and-read”實(shí)驗(yàn)的分析，由于其靈敏度很高，從而可以檢測(cè)低豐度表達(dá)的細(xì)胞膜蛋白。該儀器不僅能夠快速進(jìn)行單激光掃描，而且可以同時(shí)進(jìn)行405,488,640nm激光掃描，因此可以進(jìn)行多種熒光素的選擇。其可以不依賴于激發(fā)光直接對(duì)發(fā)射熒光進(jìn)行矯正的能力，從而在抗體篩選應(yīng)用中可以對(duì)珠子和細(xì)胞進(jìn)行多重分析。

    該文章中以人EGFR抗體與細(xì)胞表面EGFR抗原結(jié)合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應(yīng)用。EGFR配體的蛋白家族參與了細(xì)胞遷移，粘附和分化等活動(dòng)，包括乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌在內(nèi)的許多疾病都和EGFR的過(guò)度表達(dá)有著密切的關(guān)系，因此抑制EGFR的表達(dá)和激活在治療這些疾病過(guò)程中起著非常重要的作用。

    為了檢測(cè)mirrorball的檢測(cè)敏感性，該通訊利用兩種高表達(dá)EGFR的上皮癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A431進(jìn)行檢測(cè)不同濃度的抗EGFR受體與EGFR的結(jié)合能力的分析。傳統(tǒng)篩選方法是采用表達(dá)和不表達(dá)抗原的細(xì)胞分別進(jìn)行抗體的結(jié)合能力以達(dá)到篩選抗原特異性的抗體，譬如利用轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞和未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞進(jìn)行反篩選。如果利用已有的篩選平臺(tái)（例如： ELISA和FMAT），需要進(jìn)行制備兩種板以比較抗體對(duì)這兩種細(xì)胞的結(jié)合能力，從而確定抗原特異性的結(jié)合能力。

    在該實(shí)驗(yàn)中，mirrorball可以在一個(gè)細(xì)胞微孔板中對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行抗體結(jié)合能力的測(cè)定，以區(qū)分抗體對(duì)不同細(xì)胞的特異性結(jié)合。mirrorball的這種多元化分析能力在大大降低實(shí)驗(yàn)的成本的同時(shí)，可以提高篩選的通量，排除微孔板之間的差異。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

    該文章對(duì)表達(dá)EGFR受體的的A549和A431兩種細(xì)胞進(jìn)行了比較，A549，A431和Jurkat細(xì)胞購(gòu)自Sigma。三種細(xì)胞的培養(yǎng)條件如下，A549細(xì)胞：含有10%FBS的DMEM，2mM L-glutamine和100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；A431細(xì)胞：含有10%FBS的EBSS（Sigma），2mM glutamine，1×Non-essential Amino Acids(NEAA)(Sigma), 100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；Jurkat細(xì)胞：RMPI-1640（Sigma），10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素。A431和A549細(xì)胞培養(yǎng)到80%的密度時(shí)，利用0.25%胰酶和EDTA進(jìn)行消化，洗滌，重懸到新的培養(yǎng)基中。未有標(biāo)注的培養(yǎng)試劑均來(lái)自于Life Technologies。

抗體和試劑

    鼠抗人EGFR抗體購(gòu)自Merck Chemical公司（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor 647檢測(cè)標(biāo)志物（#A21235）來(lái)自于Life Technolgy。

CSFE和BiO標(biāo)記

    將5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester CFSE（sigma）溶解到DMSO中，使得CSFE濃度為100mM。將10nM CSFE加入細(xì)胞中，在室溫條件下孵育10分鐘，接著加入4%PBS（2ml）終止孵育，在37℃孵育10分鐘。將細(xì)胞進(jìn)行洗滌，在1000×g轉(zhuǎn)速下離心5分鐘。對(duì)于細(xì)胞計(jì)數(shù)分析，30nM的DiO（Life Technology）加入分析的混合物中，進(jìn)行孵育過(guò)夜。將細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后，在488nm的激光下激發(fā)，在FL-1通道中檢測(cè)細(xì)胞的熒光信號(hào)。

EGFR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)   

    將抗EGFR抗體在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋后的不同濃度抗體20ul加入384孔微孔板中（Costar 3712）。制備含有1.25×105 細(xì)胞/毫升的懸浮細(xì)胞（A431或者A549）和6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標(biāo)記物的混合物。將20ul細(xì)胞混懸液分別加入含有抗體的微孔板中，然后將微孔板在37℃孵育過(guò)夜。在mirrorball對(duì)微孔板進(jìn)行檢測(cè)從而確定結(jié)合到細(xì)胞上的抗EGFR的量。

細(xì)胞多重分析實(shí)驗(yàn)   

    將20ul稀釋后的不同濃度的抗EGFR抗體加入384微孔板中。制備含有相同細(xì)胞數(shù)的EGFR+A549和CSFE標(biāo)記的EGFR- Jurkat細(xì)胞混懸液（總細(xì)胞1.25×105 細(xì)胞/毫升，6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標(biāo)記物）。該實(shí)驗(yàn)是將20ul的細(xì)胞混懸液加入含有20ul的抗EGFR抗體的微孔板中（反應(yīng)孔中的細(xì)胞數(shù)為2.5×103 細(xì)胞和3nM檢測(cè)標(biāo)記物）。將微孔板在37℃中孵育過(guò)夜后， 放入mirrorball中利用488nm和640nm激光同時(shí)掃描檢測(cè)CSFE染料和結(jié)合的抗體的熒光強(qiáng)度。

mirrorball數(shù)據(jù)收集和掃描

   樣品利用mirrorball上的488nm和640nm的激光進(jìn)行掃描。每個(gè)孔的物體可以利用TTP Labtech專利的閾值運(yùn)算進(jìn)行在位分析，同時(shí)可以提供形態(tài)和熒光參數(shù)。數(shù)據(jù)可以mirrorball特有的Cellista 軟件通過(guò)多種方式進(jìn)行顯示，包括柱狀圖，散點(diǎn)圖，3D熒光強(qiáng)度分布圖，整個(gè)孔的圖片。

結(jié)果

EGFR的Mix-and-read 分析的檢測(cè)靈敏度

    在該研究中，為了在細(xì)胞水平結(jié)合實(shí)驗(yàn)中評(píng)估檢測(cè)的靈敏度，A431和A549細(xì)胞，不同濃度的EGFR抗體和Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗鼠IgG共同孵育過(guò)夜。圖1表明在A431細(xì)胞上EGFR抗體的檢測(cè)濃度為5ng/ml，而在A549細(xì)胞上其檢測(cè)限為5-10ng/ml。這表明EGFR在A549細(xì)胞上的表達(dá)水平比A431細(xì)胞表達(dá)水平低。   

    該結(jié)果表明利用mirrorball檢測(cè)抗EGFR抗體的水平和已經(jīng)退出市場(chǎng)的FMAT的檢測(cè)結(jié)果是一致的。兩種檢測(cè)方法在抗體濃度高于100ng/ml 時(shí)均出現(xiàn)總熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象，該現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于文獻(xiàn)所說(shuō)的“鉤子效應(yīng)”。由于一抗的過(guò)量存在，從而使得結(jié)合在檢測(cè)抗體的熒光無(wú)法讀取。

圖1. A431/A549上的總熒光強(qiáng)度隨抗EGFR抗體濃度增加而加強(qiáng)。

多激光掃描

    mirrorball的三激光使得用戶可以利用多種熒光標(biāo)記的標(biāo)志物進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。在該研究中，A549細(xì)胞被DiO標(biāo)記（488nm激光激發(fā)），同時(shí)利用EGFR抗體和AlexaFluor 647標(biāo)記物進(jìn)行多重分析。經(jīng)過(guò)過(guò)夜的孵育，利用488nm和640nm雙重激光進(jìn)行細(xì)胞數(shù)和EGFR標(biāo)記分析。圖2表明在細(xì)胞數(shù)目恒定的情況下，，細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度隨著EGFR抗體濃度的增加而加強(qiáng)。非常重要的一個(gè)特征，細(xì)胞數(shù)目可以在沒(méi)有EGFR抗體結(jié)合的情況下得到。

圖2：A549細(xì)胞總熒光強(qiáng)度隨著EGFR濃度增加而加強(qiáng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)可單獨(dú)讀取。

細(xì)胞的多重分析

    mirrorball所獨(dú)有的多種激光同時(shí)掃描特征可以在轉(zhuǎn)染和宿主混合細(xì)胞中區(qū)分出抗原表達(dá)和未表達(dá)的細(xì)胞群體。為了闡明該方面的特性，在A549（EGFR+）和CSFE標(biāo)記的Jurkat （EGFR-）進(jìn)行EGFR抗體的結(jié)合篩選實(shí)驗(yàn)。在分析之前，將Jurkat細(xì)胞進(jìn)行CSFE（10nM）的染色。圖3顯示了A549和Jurkat細(xì)胞在100ng/ml抗體的結(jié)合條件下的3D熒光強(qiáng)度圖譜，可以看到EGFR抗體特異性結(jié)合到A549細(xì)胞，在Jurkat細(xì)胞未檢測(cè)EGFR抗體的結(jié)合。

圖3： 細(xì)胞計(jì)數(shù)的三維分析。在混合細(xì)胞中，mirrorball利用多重激光掃描，可以同時(shí)檢測(cè)A549和Jurkat細(xì)胞的熒光信號(hào)。

    圖4顯示利用A549單一細(xì)胞和A549，Jurkat混合細(xì)胞進(jìn)行EGFR抗體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)靈敏度的沒(méi)有明顯的差異。

圖4：利用單一A549細(xì)胞和Jurkat，A549細(xì)胞進(jìn)行EGFR結(jié)合實(shí)驗(yàn)的比較。利用單一細(xì)胞群體和混合細(xì)胞對(duì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)沒(méi)有明顯的差異。

討論

    TTP Labtech公司的mirrorball微孔板計(jì)數(shù)儀為細(xì)胞表面抗原抗體的篩選試驗(yàn)提供一種穩(wěn)健，即混即讀的方法。該儀器非常適合抗體的研發(fā)，其獨(dú)有的光學(xué)元件和軟件設(shè)計(jì)使得該儀器具有極高檢測(cè)靈敏度，足夠檢測(cè)低豐度的蛋白的結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

    該文章表明EGFR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非常簡(jiǎn)單，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的修改即可在mirrorball上進(jìn)行分析。這種“Mix-and-read”分析方法與傳統(tǒng)的ELISA步驟比較可以免去洗滌，孵育步驟，從而大大節(jié)省篩選所需要的時(shí)間。 同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)采用較少的樣品和試劑消耗使得實(shí)驗(yàn)的花費(fèi)大大節(jié)省。

    mirrorball是提供多激光同時(shí)掃描的第一代分析系統(tǒng)，可以對(duì)熒光進(jìn)行激光之間的矯正。與合適的熒光試劑結(jié)合使用，這種多激光的同時(shí)掃描的能力可以進(jìn)行獨(dú)立的細(xì)胞識(shí)別和多參數(shù)分析，提供篩選的通量，大大降低實(shí)驗(yàn)的成本，使得實(shí)驗(yàn)操作非常的便利。在該文章中，采用DiO的反染，細(xì)胞數(shù)目可以不依賴于抗體的結(jié)合而直接進(jìn)行測(cè)定，這樣可以排除由于細(xì)胞接種的不同或者細(xì)胞毒性引起的假陽(yáng)性。

    另外，mirrorball擁有在同一個(gè)孔中能夠區(qū)分出宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了特定基因細(xì)胞的能力，該能力可以極大的加速抗體篩選的進(jìn)程。mirrorball還擁有在同一孔對(duì)A431和Jurkat細(xì)胞進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)的能力。 細(xì)胞的多重分析擁有很多優(yōu)勢(shì)，譬如可以排除不同細(xì)胞之間的板間差異，篩選通量增加一倍，減少樣品的使用量。

參考文獻(xiàn)
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