多囊卵巢綜合征病人基因組的DNA甲基化免疫沉淀反應(yīng)分析

瀏覽次數(shù)：1920　發(fā)布日期：2013-8-30　來源：上海伯豪生物技術(shù)有限公司

多囊卵巢綜合征 (Polycystic ovary syndrome, PCOS)是一種復(fù)雜的、病因不明的疾病，最新研究結(jié)果表明，胰島素耐受(insulin resistance , IR)在PCOS的發(fā)生過程中起了重要的作用。本研究主要致力于探究IR在PCOS發(fā)生過程中的分子機(jī)制，運(yùn)用基因組DNA甲基化免疫沉淀技術(shù)（methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP)，分析了正常人與PCOS病人基因組中有差異的甲基化基因，此外，還鑒別了胰島素不耐受的PCOS病人(PCOS-non-insulin resistance , PCOS-NIR)與胰島素耐受的PCOS病人( PCOSinsulinresistance ,PCOS-IR)差異的甲基化基因。結(jié)果表明，PCOS-NIR與PCOS-IR病人有79個(gè)差異的甲基化基因，PCOS病人與正常人有40個(gè)差異的甲基化基因。研究者通過構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)來分析這些差異基因，此外，他們還通過GO功能注釋以及通路富集分析來研究網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)功能。研究者將兩組比較得出的差異的甲基化基因進(jìn)行分類，經(jīng)過GO注釋后發(fā)現(xiàn)，PCOS-NIR與PCOS-IR病人在免疫應(yīng)答反應(yīng)中的甲基化基因有顯著的差異，此外，癌癥信號通路上的基因在兩組中均有顯著的甲基化差異。這篇研究有助于更好的闡明PCOS發(fā)生的分子機(jī)制。

本文是由上海仁濟(jì)醫(yī)院的狄文教授與蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所的曹聰教授共同合作完成的，其團(tuán)隊(duì)主要采用MeDIP技術(shù)完成了對PCOS疾病的分子機(jī)制的研究，該服務(wù)由上海生物芯片有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心提供。

該研究設(shè)立了三個(gè)組，分別是：PCOS-NIR病人組、PCOS-IR病人組以及正常人組，每組均有五位女性。

為了鑒定特異性的DNA甲基化片段，研究者設(shè)計(jì)了針對含特定甲基化片段的雌激素受體(estrogen receptor beta ,ER-β)基因的引物，進(jìn)行特殊的PCR (methylation-specific PCR, MSP)，發(fā)現(xiàn)所有樣品中甲基化片段大約為250bp左右。選取ER-β基因是因?yàn)樵摶蚺cPCOS疾病相關(guān)。

Figure 1. MS-PCR electrophoretogram showing the specificity of methylated DNA.

注：U代表unmethylated-specificprimer，M代表methylated-specific primer

通過MeDIP-chip檢測，得到PCOS-NIR與PCOS-IR病人有79個(gè)差異的甲基化基因，PCOS病人與正常人有40個(gè)差異的甲基化基因。為了獲得與這些基因相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，研究者將它們與TRANSFAC以及TRED數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，通過Cytoscape軟件構(gòu)建出了調(diào)控圖譜（Figure2）。從A圖可以看出，在該調(diào)控圖中，顯著性差異基因CEBPB通過調(diào)控一系列基因形成了一個(gè)局部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這也暗示了該基因在PCOS-IR疾病的發(fā)生過程中起了重要的作用，此外CEBPB基因還通過調(diào)控正�；駽REB1間接調(diào)控了甲基化基因ODC1，同時(shí)在該網(wǎng)絡(luò)中，甲基化基因GART直接調(diào)控了甲基化基因GOT1，間接調(diào)控了另一個(gè)甲基化基因PDE4DIP。相比之下，B圖所呈現(xiàn)出的PCOS病人與正常人的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖則非常簡單，甲基化基因EPM2A調(diào)控了兩個(gè)正常的基因MYC以及E2F2，甲基化基因ITGA4以及HMGA1分別調(diào)控了正常基因ETS1以及IGFBP1。

Figure 2.Regulatory network analysis of differentially methylated genes.

A圖表示 PCOS-NIR和PCOS-IR病人 差異的甲基化基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

B圖表示PCOS病人于正常人差異的甲基化基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

注：黃色節(jié)點(diǎn)代表甲基化的基因，粉紅色的節(jié)點(diǎn)代表正�；�

為了進(jìn)一步探究 Figure2A中各基因的生物學(xué)功能，研究者采用了在線生物學(xué)分類工具DAVID，對這些有顯著性差異的甲基化基因進(jìn)行GO分類，結(jié)果表明，最顯著的GO分類富集類型是關(guān)于防御反應(yīng)，其次是炎癥反應(yīng)，創(chuàng)傷反應(yīng)以及對細(xì)胞因子生成的調(diào)節(jié)，總體來講，這些反應(yīng)均與免疫應(yīng)答相關(guān)。

對Figure2A中基因的調(diào)控通路進(jìn)行富集分析，采用DAVID工具富集出四條通路，包括：細(xì)胞因子受體相互作用通路，造血細(xì)胞系通路，哮喘通路以及Jak-STAT信號通路。

研究者進(jìn)一步探究這些甲基化基因在蛋白水平的變化，他們將所得的差異的甲基化基因與HPRD以及BIOGRID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，構(gòu)建了蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction , PPI)網(wǎng)絡(luò)。據(jù)報(bào)道，在網(wǎng)絡(luò)中處于中心地位的基因較周圍的基因具有更關(guān)鍵的細(xì)胞學(xué)功能。從PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，可以發(fā)現(xiàn)甲基化基因CEBPB, GOT1, GET4, ODC1 以及C12orf44形成了一個(gè)局部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Figure 3A）。在PCOS病人與正常人的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，甲基化基因GSK3A, HMGA1, ITGA4,EPM2A以及BAG2成為了中心節(jié)點(diǎn)（Figure 3B）。

Figure 3.Protein-protein interaction (PPI) network analysis.

A圖表示PCOS-NIR和PCOS-IR病人的PPI網(wǎng)絡(luò)

B圖表示PCOS病人于正常人的PPI網(wǎng)絡(luò)

注：黃色節(jié)點(diǎn)代表甲基化的基因，粉紅色的節(jié)點(diǎn)代表正�；�

為了分析處于PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的基因的生物學(xué)功能，研究者對這些基因分別進(jìn)行了GO功能注釋。在PCOS-NIR和PCOS-IR病人比對組中，最顯著的GO類型是調(diào)控RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄基因，其次是氮類化合物代謝正向調(diào)控基因、高分子代謝正向調(diào)控基因。在PCOS病人和正常人的比對組中，最顯著的GO類型是正向調(diào)控高分子代謝的基因，其次是細(xì)胞生物合成正向調(diào)控基因，氮類化合物代謝正向調(diào)控基因。

此外，研究人員還對PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行了信號通路富集分析。在PCOS-NIR和PCOS-IR病人比對組中，6條信號通路被富集出來，主要關(guān)于：癌癥、慢性骨髓白血病以及前列腺癌。在PCOS病人和正常人的比對組中，5條信號通路被富集出來，涉及癌癥、ErbB信號通路以及粘著斑。

原文出處：

Genome-Wide Methylated DNA ImmunoprecipitationAnalysis of Patients with Polycystic Ovary Syndrome

Abstract：

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is a complex, heterogeneous disorder of uncertain etiology. Recent studies suggestedthat insulin resistance (IR) plays an important role in the development of PCOS. In the current study, we aimed to investigatethe molecular mechanism of IR in PCOS. We employed genome-wide methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP)analysis to characterize genes that are differentially methylated in PCOS patients vs. healthy controls. Besides, we alsoidentified the differentially methylated genes between patients with PCOS-non-insulin resistance (PCOS-NIR) and PCOSinsulinresistance (PCOS-IR). A total of 79 genes were differentially methylated between PCOS-NIR vs. PCOS-IR patients, and40 genes were differentially methylated in PCOS patients vs. healthy controls. We analyzed these differentially methylatedgenes by constructing regulatory networks and protein-protein interaction (PPI) networks. Further, Gene Ontology (GO) and

pathway enrichment analysis were also performed to investigate the biological functions of networks. We identifiedmultiple categories of genes that were differentially methylated between PCOS-NIR and PCOS-IR patients, or between PCOS

patients and healthy controls. Significantly, GO categories of immune response were differentially methylated in PCOS-IR vs.PCOS-NIR. Further, genes in cancer pathways were also differentially methylated in PCOS-NIR vs. PCOS-IR patients or inPCOS patients vs. healthy controls. The results of this current study will help to further understand the mechanism of PCOS.

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