通過SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺和Tune技術可自動掃描熒光蛋白分子來確定其最佳波長
Molecular Devices公司基于SpectraMax ®Paradigm® 多功能微孔板檢測平臺的基礎上推出了一款使用濾光片作為其單色器，但又可隨意調(diào)節(jié)其檢測波長的Tune卡盒，這種最新的檢測技術融合了濾光片的高靈敏度和波長掃描的高靈活性等特點。Tune檢測卡盒克服了傳統(tǒng)光柵型單色器的缺陷，可以方便研究人員在更廣的波長范圍內(nèi)優(yōu)化各種試驗所需的最佳波長，且檢測靈敏度也較光柵型系統(tǒng)提高了10倍以上。Tune卡盒激發(fā)光波長范圍360nm至790nm，發(fā)射波長范圍400nm至850nm，且可以做到1nm步進，它也是一種多功能檢測卡盒，除具有熒光強度（FI）檢測模式外，還具有時間分辨熒光（TRF）和化學發(fā)光（Lum）檢測模式。
SpectraMax Paradigm 檢測平臺融合了全新Tune檢測技術
具有專利的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ芸珊喕斯ぷ髁鞒�，即針對不同熒光染料分子掃描后自動計算出信號與背景的比值，找出此熒光染料分子的最佳激發(fā)與發(fā)射波長。軟件會自動生成掃描熱圖，給出根據(jù)不同掃描波長對計算后的信號與背景比值，方便用戶選擇最優(yōu)波長來完成試驗，當使用EGFP熒光染料分子進行波長的自動優(yōu)化設置后，其檢測靈敏度較使用傳統(tǒng)固定波長的方法提高了80倍以上。
激發(fā)和發(fā)射光譜掃描
單獨針對兩個綠色熒光蛋白的突變體進行激發(fā)和發(fā)射波長掃描，分別將重組野生型 GFP （Clontech） 和增強型GFP（EGFP，BioVision）都用TE緩沖液都稀釋至 10μg/ml， PH調(diào)為8 。為測量GFP樣品（50ul）光譜學特性將其加入黑色384孔板中，黑色微孔板中僅含有緩沖液的孔作為參比孔。
單獨進行激發(fā)和發(fā)射光譜掃描時，將測量時間（Integration Time）設置為140ms。當確定最佳激發(fā)波長進行掃描時，首先將發(fā)射波長設置為530nm，激發(fā)波長從360nm至500nm 且每隔2nm步進。當確定最佳發(fā)射波長進行掃描時，首先激發(fā)波長設置為440nm，發(fā)射波長從470nm至600nm且每隔2nm步進。圖一中顯示出當EGFP的發(fā)射峰在506nm（GFP）附近，即512nm(EGFP；圖一)時，其激發(fā)峰從394nm紅移至482nm。
GFP和EGFP采用Tune技術（圖一）
使用SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺和Tune技術在SoftMax Pro6軟件光譜掃描模式下獲得GFP和EGFP的光譜。我們從光譜中明顯發(fā)現(xiàn)它們的激發(fā)峰的最大值發(fā)生移動，藍色線代表GFP光譜，綠色線代表EGFP光譜，虛線代表激發(fā)光譜，實線代表發(fā)射光譜
光譜優(yōu)化向?qū)Чδ?/SPAN>
使用SoftMax Pro6軟件中的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ軄泶_定GFP和EGFP的最優(yōu)波長，用戶可以選擇激發(fā)和發(fā)射波長掃描范圍，同時也可確定波長步進度。光譜優(yōu)化向?qū)軌蛲瑫r掃描激發(fā)和發(fā)射波長，并計算每一對激發(fā)/發(fā)射波的信號與背景的比值，計算方法的公式為（信號-背景）/背景。結(jié)果以熱圖形式顯示出一對激發(fā)/發(fā)射波長，十字圖標中心的位置顯示出了最高信號與背景比值，圖二為GFP掃描結(jié)果。
優(yōu)化激發(fā)與發(fā)射波長（圖二）
光譜優(yōu)化向?qū)У慕Y(jié)果可以通過熱圖的形式顯示出來，給出了GFP熒光染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長，顯示GFP優(yōu)化后其最佳激發(fā)波長405nm、發(fā)射波長510nm，EGFP的最佳激發(fā)波長465nm、發(fā)射波長515nm(未顯示)
通過表一的數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，使用波長優(yōu)化向?qū)Чδ芎筇岣吡?/SPAN>GFP的各種突變體檢測靈敏度。GFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰相距112nm，靈敏度的提高得益于波長優(yōu)化后適度改變了激發(fā)和發(fā)射波峰，然而EGFP激發(fā)波峰與發(fā)射波峰僅相距30nm，通過光譜優(yōu)化向?qū)Чδ苡嬎愫罂傻贸鲎罴巡ㄩL可以使得檢測靈敏度提高80倍，優(yōu)化后激發(fā)和發(fā)射波峰相距50nm，降低了的激發(fā)光干擾。
表一：分別通過Tune卡盒優(yōu)化波長或固定激發(fā)和發(fā)射波峰，比較兩種方法針對GFP和EGFP兩種染料分子的檢測下線（LLDs）
結(jié)論
當用戶面對全新未知的熒光染料分子進行波長優(yōu)化時，如果通過Tune卡盒的光譜優(yōu)化向?qū)Чδ懿粌H可以自動優(yōu)化出該染料分子的最佳激發(fā)和發(fā)射波長并可以減少50%的時間。激發(fā)波長范圍360nm至790nm，發(fā)射波長范圍400nm至850nm，SpectraMax Paradigm微孔板檢測平臺加上Tune卡盒后，能夠檢測絕大多數(shù)常用的熒光染料分子，并且檢測靈敏度較傳統(tǒng)光柵型系統(tǒng)高出10倍以上。如上述試驗所示，當使用的熒光染料分子(如EGFP)的斯托克位移較窄時，通過Tune卡盒波長優(yōu)化功能可大幅度提高試驗檢測的靈敏度（提高80倍）。 Tune 卡盒除具有熒光強度檢測模式外，也提供了時間分辨熒光和化學發(fā)光的檢測模式，增加了試驗檢測方法的多樣性。
