作者：嚴(yán)雪銘（中科院上海藥物所教授，在國(guó)內(nèi)外從事骨密度儀器10多年)
張振德(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院)

【摘要】目的 采用pQcT設(shè)備，以整體小鼠脛骨為檢測(cè)對(duì)象，了解不同周齡骨密度含量以及不同組分面積，為進(jìn)行小鼠骨代謝研究提供參考。方法 4～12周齡昆明種小鼠3O只，雌性，每6只為1組。用戊巴比妥鈉麻醉后，固定于檢測(cè)臺(tái)上，以右后肢為被測(cè)對(duì)象，采用德國(guó)產(chǎn)動(dòng)物用pQcT設(shè)備，分別對(duì)脛骨近端骨骺線1．4nnn和4．0inin處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果 小鼠4～12周齡，體重增長(zhǎng)很快，周齡與體重的相關(guān)性r=O．963，P<0．001；此階段脛骨總骨密度、皮質(zhì)骨密度隨著周齡的增長(zhǎng)而增加，呈非常顯著的正相關(guān)；周齡與骨小梁的骨密度無(wú)明顯相關(guān)性；8周齡時(shí)脛骨小梁面積最大。結(jié)論 pQcT能靈敏、精確的測(cè)定整體小鼠脛骨，有效地區(qū)分各個(gè)不同組分，可以動(dòng)態(tài)的觀察骨骼的變化，以8—1O周齡的小鼠適宜造模型。

【關(guān)鍵詞】pQcT；骨密度；脛骨；小鼠

Age-related changes in bone mineral density and cross-sectional area in mice YNA Xueming．ZHANG Zhende．Shanghai Institute of Materia Medwa，Chinese Academy of Sciences，Shanghai 201203，China
【Abstract】Objective Age-relatde changes in bone mineral density(BMD)，cross—sectional area of the tibia in vivo were measured by peripheral quantitative computed tomography(pQcT)，and the correlation was analyzed，providing the reference for the resarch on bone metabolismin mice．Methods Thirty female mice were di vided into age groups of4，6，8，10 and 12 weeks，6 each．The mice werefixed withholder under anesthesia．BMD and cross-sectional area were measured by pQcT(Stratec，XCT，Research SA)at 1．4 and 4．0 mm from the proximal epiphysis of tibia．Results The body weight of female mice increased quickly during 4-12 weeks of age，and showed age dependemcy with significant correlation(r=0．963，P<O．001)；the total and cortical BMD have in creased at 4—12 weeks as well as corss-sectional area．a(chǎn)nd they werecorrelated significandy．But trabecular BMD increased slowly without correlation during the period，and the maximal trabccular area appeared at 8 weeks of age． ConclusionThe pQcT precisely defermines various regions of mouse tibia in vivo．Therefore，measurement in vivo is useful for the momtofing of skeletal changes in mice．Mice at the ages of 8-10 weeks are suitable for develop ment of osteoporosis models．

【Key words】pQcT； Bone mineral density；Tibia； Mouse

骨質(zhì)疏松癥的研究在我國(guó)雖然起步較晚，但是選擇合適的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型是進(jìn)行骨質(zhì)疏松藥物篩選的基礎(chǔ)，同時(shí)必須有靈敏、精確的檢測(cè)手段，才能事半功倍。

pQcT(peripheral quantitative computed tomography)外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描是非侵入性的檢測(cè)方法，檢測(cè)對(duì)象可從實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物到人類骨骼。可對(duì)骨樣 品的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨分別進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精確度均高于DEXA^[1,2]。在國(guó)外的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被廣泛地應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的診斷和治療效果的評(píng)價(jià)。國(guó)內(nèi)對(duì)pQcT的使用及有關(guān)的報(bào)道很少，尤其未見(jiàn)到小鼠的檢測(cè)數(shù)據(jù)。本研究采用pQcT設(shè)備，以4一l2周齡整體小鼠脛骨為檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行比較，旨在為進(jìn)行有關(guān)小鼠骨代謝的研究提供參考。

材料和方法

1．方法：30只昆明種小鼠。雌性。體重l6—40g，(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，分別為4,6,8，10，12周齡，每組6只，經(jīng)1d適應(yīng)性飼養(yǎng)，用戊巴比妥鈉麻醉，途徑ip，劑量60mg·kg^-1，動(dòng)物麻醉后固定于特制的檢測(cè)臺(tái)上，以右后肢為被測(cè)對(duì)象。

2．儀器和檢測(cè)：pQcT(peripheral quantitative computed tomography)，XCTResearchSA(德國(guó)Stratec公司生產(chǎn))，檢測(cè)時(shí)先縱向掃描，顯示右后肢脛骨近端的形態(tài)，以骨骺線為參照線向下1．4mm和4．0mm處作斷層測(cè)定。計(jì)算指標(biāo)為骨密度(mg／cm³)和面積(mm²)。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:每組結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差( ±s)表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較，應(yīng)用MicrosoftExcel2000將獲 得的數(shù)據(jù)進(jìn)行雙方差線性pearson相關(guān)分析。

結(jié)果

1．小鼠4～12周齡是體重增長(zhǎng)較快的時(shí)期，隨著周齡的增長(zhǎng)體重明顯增加r=0．963，P<0．001)，見(jiàn)圖1。

2．脛骨被測(cè)部位不同，其骨密度有異同，在1．4 mm處，總骨密度和皮質(zhì)骨密度隨著周齡的增長(zhǎng)逐漸增加，呈正相關(guān)，分別是r=0．614，P<0．01和r=0．631，P<0．001；在4．0mm結(jié)果也相似，r=0．770，P<0．001和r=0．790，P<0．001，相關(guān)性比前者更 好。骨小梁骨密度兩斷層數(shù)據(jù)與周齡無(wú)相關(guān)性，分別為r=0．056，P>0．05和r=0．289，P>0．05。但是前者明顯高于后者，并處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，見(jiàn)表1

3．被測(cè)脛骨部位不同，其組成的面積也有差異，總面積和皮質(zhì)面積隨著動(dòng)物周齡的增長(zhǎng)逐漸增大，但是小梁面積以8周齡為最大值，見(jiàn)表2。

討論

隨著社會(huì)進(jìn)入老齡化，骨質(zhì)疏松患者日益增多，對(duì)骨質(zhì)疏松癥的研究越來(lái)越深入。目前，檢測(cè)設(shè)備日趨高靈敏度、高精確度以及快捷、方便、安全。pQcT(外周骨定量計(jì)算機(jī)斷層掃描)已具備了這些條件^[3]，在國(guó)外的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的診斷和治療效果的評(píng)價(jià)。在基礎(chǔ)研究方面選擇大鼠進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松藥物文獻(xiàn)報(bào)道較多，但是大鼠作為整體模型具有成本高、周期長(zhǎng)、用藥量大等缺點(diǎn)，不利于篩選新藥的研究和開(kāi)發(fā)。

小鼠來(lái)源方便、經(jīng)濟(jì)，是實(shí)驗(yàn)室常用的一種動(dòng)物，性成熟為4O～50d。本研究選擇了國(guó)內(nèi)最常用的昆明種雌性小鼠，4—12周齡，此時(shí)的動(dòng)物生長(zhǎng)最旺盛，一般的動(dòng)物飼養(yǎng)中心都能及時(shí)供應(yīng)。圖1表明，小鼠4～12周齡與體重呈正相關(guān)，r=0．963，P<0．001。

整體動(dòng)物骨骼檢測(cè)，雖然條件的控制與離體樣品比較難度要大，但是可以節(jié)約成本、減少實(shí)驗(yàn)誤差，可以動(dòng)態(tài)的觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各種變化，評(píng)價(jià)藥物作用等有利因素，更易被人們接受。

本研究經(jīng)預(yù)初的pQcT對(duì)小鼠的檢測(cè)，選擇了脛骨近端骨骺線1．4mm和4．0mm處作斷層測(cè)定，因?yàn)榍罢咭运少|(zhì)骨為主，后者密質(zhì)骨相對(duì)較多，見(jiàn)表1。結(jié)果證實(shí)距骨骺線越遠(yuǎn)密質(zhì)骨越多，總骨密度也越高。隨著小鼠周齡增加，其骨密度值也相應(yīng)提高，4～12周齡與其脛骨總骨密度、皮質(zhì)骨密度有顯著的相關(guān)性，而4．0mm處(r=0．770，P<0．001和r=0．790，P<0．001)相關(guān)性比1．4mm(r=．614，P<0．01和r=0．631，P<0．001)更好。因此通過(guò)骨密胞質(zhì)，在核周聚集明顯。定量檢測(cè)中免疫細(xì)胞化學(xué)和Westemblot結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)均勻雙軸機(jī)械刺激在各時(shí)段COX-2的表達(dá)不同，當(dāng)均勻雙輪機(jī)械刺激為2h時(shí)，即使最大強(qiáng)度的刺激(200000microstrsain)也不足以引起成骨細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯的增加，而當(dāng)機(jī)械刺激的時(shí)間超過(guò)4h以上(包括8h組)時(shí)即使最小的刺激強(qiáng)度(20000microstrain)也能促進(jìn)成骨細(xì)胞COX-2蛋內(nèi)的表達(dá)，提示了導(dǎo)致成骨細(xì)胞COX-2表達(dá)的增高，機(jī)械刺激必需要維持一定的時(shí)間，即有一個(gè)機(jī)械刺激的時(shí)間閾值。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)刺激4h組成骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)隨均勻雙軸機(jī)械刺激強(qiáng)度的增加而逐漸升高，提示了成骨細(xì)胞COX-2表達(dá)的高低與機(jī)械刺激的強(qiáng)度也是密切相關(guān)的，即存在一個(gè)機(jī)械刺激的強(qiáng)度閾值。然而機(jī)械刺激作用8h時(shí)，成骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)與對(duì)照組相比雖然有明顯的增高，但是隨機(jī)械刺激的增加而降低，與4h時(shí)的趨勢(shì)正好相反，分析原因可能是因?yàn)闄C(jī)械刺激的作用超出生理性的閾值，反而中斷了成骨細(xì)胞內(nèi)機(jī)械刺激的信號(hào)傳導(dǎo)通路，不能使成骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)繼續(xù)上調(diào)。以上結(jié)果揭示了成骨 細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)與均勻雙軸機(jī)械刺激的強(qiáng)度和作用的時(shí)間都有關(guān)，并且只有機(jī)械刺激的強(qiáng)度(20000～200000microstrain)和時(shí)間(2～8h)在適當(dāng)?shù)姆秶鷷r(shí)才會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)。

本研究初步探討了均勻雙軸機(jī)械刺激與成骨細(xì)胞COX-2表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了一定時(shí)間和強(qiáng)度的均勻雙軸機(jī)械刺激可以促進(jìn)體外成骨細(xì)胞COX-2的表達(dá)，希望能對(duì)臨床的牽引成骨有理論上的支持與揭示。

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