高通量細(xì)胞遷移篩選

    細(xì)胞遷移是一個活的生物生長和維持生命過程中不可缺少的的關(guān)鍵過程。為了完成相應(yīng)的功能，體內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)常會以特定的方向遷移到特定的位置。遷移是一個循環(huán)的過程，細(xì)胞向前端伸出突觸，縮回其尾端。動物組織中的細(xì)胞發(fā)生遷移主要是為了響應(yīng)特定的外部信號。

    細(xì)胞遷移對于胚胎發(fā)育、傷口愈合、分化以及免疫應(yīng)答等都是非常重要的過程。細(xì)胞遷移是血管疾病，慢性炎癥疾病以及腫瘤形成等疾病的致病機(jī)理。因此，對那些具有促進(jìn)（傷口愈合）或者抑制（腫瘤形成）細(xì)胞遷移作用的化合物的研究就具有非常重要的治療意義。我們已經(jīng)建立了一個使用Molecular Devices公司的SpectraMax paradigm多功能檢測平臺進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的，自動化的高通量細(xì)胞遷移分析新方法。相對于劃痕分析或者其他的2D傷口閉合實驗，這個分析方法更加簡單，更具可重復(fù)性。

試驗描述

    Oris細(xì)胞遷移試驗（non-coated）（Platypus Technologies，Madison，WI）使用細(xì)胞種植抑制板（cell seeding stoppers）在每個孔的中央形成2mm直徑的檢測區(qū)域。人黑色素瘤細(xì)胞（50000每孔）被種植到安裝有細(xì)胞種植抑制板的96微孔板。過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞貼附到微孔板板底，在抑制板的作用下，形成中央2mm的細(xì)胞空白區(qū)域。移走抑制板，然后對細(xì)胞不做處理或者使用可溶性的趨化因子CXCL9以濃度依賴的方式處理，或者使用100ng/ml不同生物活性的化合物或者latrunculin（1ug）作為陰性對照進(jìn)行處理。然后，黑色素瘤細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)16個小時。使用CellTracker Green（Invitrogen）對細(xì)胞染色，微孔板的底部加入Oris檢測屏蔽（Detection Mask）（圖1）。發(fā)生細(xì)胞遷移進(jìn)入檢測區(qū)域的細(xì)胞使用共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP2）進(jìn)行成像，數(shù)據(jù)使用SpectraMax paradigm檢測平臺進(jìn)行定量確證（圖2）。

圖1：Oris細(xì)胞遷移試驗原理

圖2：Paradigm檢測平臺

圖3：篩選潛在的細(xì)胞遷移刺激或者抑制因子。通過使用SpectraMax Paradigm檢測平臺讀取Oris細(xì)胞遷移（微孔板底貼附有檢測屏蔽——detection mask）的熒光強(qiáng)度來檢測黑色素瘤細(xì)胞遷移的程度。試驗做三個復(fù)孔。

結(jié)果

    為了研究和評估新分離的活性化合物的遷移效應(yīng)，我們使用人黑色素瘤細(xì)胞，使用不同的潛在遷移刺激或者抑制因子進(jìn)行處理（趨化因子CXCL9，Latrunculin和活性化合物）。我們通過檢測16小時后的熒光強(qiáng)度（終點法檢測）來評估細(xì)胞遷移進(jìn)入檢測區(qū)域的程度。圖3總結(jié)了化合物的黑色素瘤細(xì)胞遷移效應(yīng)篩選結(jié)果。CXCL9顯示出劑量依賴性的檢測區(qū)域熒光強(qiáng)度增加（發(fā)生遷移的細(xì)胞），而Latrunculin沒有遷移效應(yīng)。盡管許多活性化合物沒有顯示出或者僅顯示出很低的遷移效應(yīng)，化合物12和15卻明顯促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞遷移進(jìn)入檢測區(qū)域。倍增誘導(dǎo)水平計算方法：每個孔的熒光強(qiáng)度值（RFU）除以陰性對照的平均RFU值。每個樣品的平均值和SD值也被計算出來。

結(jié)論

    這個試驗系統(tǒng)證實了一個有用的工具，可以用于高通量的檢測細(xì)胞遷移，高通量的藥物篩選。這個研究將Oris細(xì)胞遷移分析和SpectraMax Paradigm檢測平臺聯(lián)合，通過檢測熒光強(qiáng)度來對細(xì)胞遷移的程度進(jìn)行定量。這個系統(tǒng)能夠區(qū)分多種多樣的細(xì)胞遷移刺激因子和抑制因子。

作者：

Christoph Wiesner，Maren Pfluger，Constantin Bujnow，Katrin Eisenberger，Wolfgang Schutt，Andreas Eger and Harald Hundsberger

聯(lián)系：

University of Applied Science Krems Krems，Austria

harald.hundsberger@fh-krems.ac.at