這篇文章主要描述了當(dāng)使用Molecular Devices公司推出的SpectraMax® Paradigm® 微孔板檢測(cè)儀檢測(cè)Bellbrook 實(shí)驗(yàn)室的Transcreener熒光偏振系列試劑盒時(shí)，如何對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以滿足其驗(yàn)證要求。

 

•            Transcreener ADP2 FP (3010)

•            Transcreener AMP/GMP (3006)

•            Transcreener UDP FP (3007)

•            Transcreener GDP FP (3009)

 

Transcreener高通量篩選試驗(yàn)是基于對(duì)體系內(nèi)數(shù)千種不同細(xì)胞酶在催化底物時(shí)獲得ADP后，檢測(cè)其ADP含量的一種通用性，高通量生化檢測(cè)平臺(tái)。這些酶中的大部分能催化細(xì)胞信號(hào)通路中的共價(jià)反應(yīng)，是藥物篩選的高價(jià)值靶點(diǎn)。Transcreener 熒光偏振試驗(yàn)采用單步、免疫競(jìng)爭(zhēng)法，直接檢測(cè)標(biāo)記有遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子的核苷酸偏振值，其所有試驗(yàn)的檢測(cè)試劑均由遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子與高特異性的單克隆或多克隆抗體結(jié)合而成，原理是在靶標(biāo)酶催化底物后，所產(chǎn)生的核苷二磷酸或者單核苷酸競(jìng)爭(zhēng)性的取代了抗體連接的遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子，其遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子的旋轉(zhuǎn)自由度增高，導(dǎo)致熒光偏振現(xiàn)象的減弱（如圖1），使用遠(yuǎn)紅外熒光示蹤分子可以有效降低熒光化合物和光散射的干擾，Transcreener 熒光偏振試驗(yàn)均采用一步添加，混勻既讀的方式，特別適合高通量篩選。

 

SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測(cè)儀采用靈活的卡盒式設(shè)計(jì)，可以針對(duì)不同試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)類型選擇最適合的檢測(cè)卡盒以獲得最佳檢測(cè)結(jié)果，儀器所具有雙光電倍增二極管（PMT）能夠同時(shí)工作，用以檢測(cè)熒光偏振信號(hào)值，做到在不降低檢測(cè)靈敏度的同時(shí)提高其檢測(cè)速度。儀器不但可以支持1536孔板且能夠與MD公司推出的StakMax®堆板機(jī)進(jìn)行整合，大大增加了檢測(cè)的速度和通量。針對(duì)Transcreener熒光偏振試驗(yàn)的特點(diǎn)對(duì)儀器進(jìn)行優(yōu)化設(shè)置后，SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測(cè)儀的表現(xiàn)完全超過了試驗(yàn)本身對(duì)儀器性能的要求。

 

為了發(fā)揮Transcreener高通量篩選檢測(cè)試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)，其中關(guān)鍵性因素是如何對(duì)微孔板檢測(cè)儀進(jìn)行參數(shù)上的設(shè)置和優(yōu)化，無論是針對(duì)那種類型的檢測(cè)試驗(yàn)，正確的參數(shù)設(shè)置和優(yōu)化都會(huì)增加其檢測(cè)的靈敏度。為了找到適合Transcreener高通量篩選試驗(yàn)的最佳參數(shù)設(shè)置，我們做出24條重復(fù)的模擬10uM ATP/ADP酶的反應(yīng)過程的標(biāo)準(zhǔn)曲線。起始濃度為10uM ATP，其中ADP含量的增加與ATP含量的減少是成一定的比例關(guān)系，維持總腺嘌呤核苷酸濃度在10uM左右。通過改變不同的檢測(cè)時(shí)間(Integration time)來滿足其試驗(yàn)Z值>0.5的要求，驗(yàn)證一臺(tái)儀器是否能夠滿足Transcreener熒光偏振試驗(yàn)的要求，在10uM ATP的轉(zhuǎn)化率為10%的情況其Z值>0.7且ΔmP > 120。

 

•            ATP/ADP混合物-4 mM MgCl₂、2 mM EGTA、50 mM HEPES、pH 7.5、1% DMSO

0.01% Brij-35和ATP/ADP（腺嘌呤濃度為10uM）

•            ADP檢測(cè)混合物-1x終止&檢測(cè)緩沖液B、4 nM ADP Alexa633示蹤分子和14.8 ug/ml ADP²抗體

•            單示蹤分子-1x終止液&檢測(cè)緩沖液B和4 nM ADP Alexa633示蹤分子

•            空白緩沖液-1x終止液&檢測(cè)緩沖液B和14.8 ug/ml ADP²抗體

 

詳細(xì)的檢測(cè)步驟，包括準(zhǔn)備制作標(biāo)曲、請(qǐng)參照Transcreener技術(shù)手冊(cè)()

 

步驟一：將10ul的ATP/ADP化合物分別加入384孔板的每行中

步驟二：在這些行中加入10ul ADP混勻

步驟三：加入10ul的10 μM ATP/0 μM ADP化合物于384孔板的行P中

步驟四：在P1-P12行中的每孔中加入10ul的單示蹤分子

步驟五：在P13-P24行中的每孔中加入10ul的空白緩沖液

 

SpectraMax Paradigm微孔板檢測(cè)儀由SoftMax® Pro 軟件控制，可以在其軟件模板庫中選擇此試驗(yàn)類型的模版文件并更改其具體的參數(shù)設(shè)置。

 

步驟一：打開SoftMax Pro操作軟件，點(diǎn)擊‘Protocol Manager’選項(xiàng)，在其‘Protocol Library’即模版庫中選擇預(yù)先設(shè)置好的模版，在‘Paradigm Protocol’文件夾下選擇‘FP Rhodamine’模版

步驟二：點(diǎn)擊軟件左側(cè)導(dǎo)航樹的‘Plate01’后，再點(diǎn)擊右側(cè)的‘Settings’即設(shè)置按鍵（齒輪狀圖標(biāo)），出現(xiàn)設(shè)置對(duì)話框

步驟三：選擇Alexa Fluor633 熒光偏振卡盒

步驟四：檢測(cè)模式選擇‘FP’即熒光偏振模式，檢測(cè)類型選擇‘Endpoint’即終點(diǎn)法

步驟五：卡盒已固定其檢測(cè)波長，無需再設(shè)置

步驟六：點(diǎn)擊‘Plate Type’后選擇‘384 wells’微孔板類型，然后選擇‘384 Well

Corning low vol/rndbtm’

步驟七：點(diǎn)擊‘Read Area’選擇微孔板檢測(cè)區(qū)域（孔）

步驟八：點(diǎn)擊‘PMT and Optics’選擇‘Off – Stop and Go’或‘Performance – On the fly’讀取速度模式

步驟九：如果選擇Stop and Go模式時(shí)，在‘integration time’ 處輸入20ms或者更高數(shù)值，延長時(shí)間可以獲得更好的結(jié)果，但是會(huì)延長檢測(cè)時(shí)間

步驟十：如果已知最佳檢測(cè)高度，直接輸入即可，當(dāng)采用新試驗(yàn)或者新微孔板時(shí)，應(yīng)該重新進(jìn)行高度優(yōu)化設(shè)置，高度優(yōu)化前的原始值為1mm，進(jìn)行優(yōu)化后，新的高度值會(huì)取代原始值

步驟十一：點(diǎn)擊‘More Settings’，選擇以行或者列的方式來確定檢測(cè)順序

步驟十二：選擇‘Show Pre-Read Optimization Options’

步驟十三：點(diǎn)擊‘OK’鍵后關(guān)閉設(shè)置對(duì)話框

步驟十四：點(diǎn)擊‘Read’按鍵，屏幕中央會(huì)出現(xiàn)一個(gè)優(yōu)化選擇對(duì)話框，針對(duì)新試驗(yàn)需重新進(jìn)行微孔板優(yōu)化和檢測(cè)高度的優(yōu)化

 

反應(yīng)過程中，伴隨著ADP含量的增加，其與ATP比例發(fā)生變化，與抗ADP抗體結(jié)合的示蹤分子減少，導(dǎo)致了反應(yīng)體系中熒光偏振信號(hào)值降低，SpectraMax Paradigm針對(duì)此試驗(yàn)中所給出的15個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)后，得出數(shù)值后自動(dòng)擬合生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 

 

A：模擬10uM ATP轉(zhuǎn)化至ADP時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的Z值和Δ mP值；B：當(dāng)微孔板檢測(cè)儀設(shè)置為100ms檢測(cè)時(shí)間，放大標(biāo)準(zhǔn)曲線視圖，ADP濃度范圍在0-3uM之間時(shí)顯示出驗(yàn)證Z值的最少數(shù)據(jù)點(diǎn)（紅色虛線）和驗(yàn)證Δ mP值的最少數(shù)據(jù)點(diǎn)(水平黑色虛線)，也顯示出10%ATP轉(zhuǎn)化驗(yàn)證點(diǎn)（垂直黑色虛線）

 

此篇應(yīng)用文驗(yàn)證了Molecular Devices推出的SpectraMax Paradigm多功能微孔板檢測(cè)儀能夠滿足Transcreener熒光偏振檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)儀器性能的要求，我們對(duì)儀器參數(shù)進(jìn)行設(shè)置和優(yōu)化后，可以在1分鐘以內(nèi)獲得相應(yīng)值（Z值>0.7和Δ mP > 120），當(dāng)延長檢測(cè)時(shí)間時(shí)，其結(jié)果遠(yuǎn)超過最低驗(yàn)證最低要求，當(dāng)使用‘on-the-fly’飛行檢測(cè)模式時(shí)，仍能滿足試驗(yàn)需求且檢測(cè)時(shí)間小于1分鐘。

 

Molecular Devices公司對(duì)Bellbrook實(shí)驗(yàn)室的Meera Kumar女士的大力協(xié)作表示衷心的感謝