摘要 目的:研究長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合物 I 和復(fù)合物 Ⅳ活性的影響,并探討其機(jī)制。

方法:以C57 BL/6J雄性小鼠跑轉(zhuǎn)籠為運(yùn)動(dòng)方式,通過分光光度法和極譜氧電極法測(cè)定線粒體復(fù)合物 I和復(fù)合物 Ⅳ的活性。 結(jié)果:隨著小鼠年齡的增長(zhǎng),

骨骼肌線粒體復(fù)合物 I (NADH脫氫酶)活性顯著下降,復(fù)合物 IV (細(xì)胞色素氧化酶)活性無明顯變化。經(jīng)過 8個(gè)月運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合物 I及復(fù)合物 IV 活性明顯升高,顯著高于同齡對(duì)照鼠甚至高于5月齡鼠。結(jié)論:運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一定程度上致骨骼肌線粒體功能產(chǎn)生適應(yīng)性變化。

關(guān)鍵詞:運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練;骨骼肌線粒體;復(fù)合物I;復(fù)合物IV

線粒體DNAmt DNA 編碼的復(fù)合物I和IV的活性隨增齡而下降明顯,但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)復(fù)合物 I和 IV 的研究報(bào)道很少。本文以C57BL/6J 雄性小鼠跑轉(zhuǎn)籠為運(yùn)動(dòng)方式, 研究了從5月齡開始進(jìn)行為期8個(gè)月的長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合物 I和復(fù)合物 IV 活性的影響。

1 資料和方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)模型的建立 本研究選擇30只近交系C57BL/6J雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,2月齡小鼠購自第一軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠5月齡后隨機(jī)取 10只處死進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)試,此組為5月齡鼠。隨機(jī)取10只開始運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練,訓(xùn)練的方式為跑轉(zhuǎn)籠 ( running wheel) ,將小鼠放進(jìn)直徑為17cm的帶軸承轉(zhuǎn)籠,讓其主動(dòng)跑籠,第1天跑10 min ,以后每天增加10 min ,直至每天1h ,自動(dòng)記錄跑籠圈數(shù)。每天跑籠1h ,每周5 d ,所有運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均在動(dòng)物暗周期6pm～10 pm完成,剩余10只對(duì)照組在相同時(shí)間放進(jìn)轉(zhuǎn)籠,但轉(zhuǎn)籠固定不動(dòng)。8個(gè)月后均達(dá)13月齡。

1. 2 主要試劑和儀器NADH、細(xì)胞色素C、抗壞血酸鈉。主要儀器有:731紫外分光光度計(jì),氧電極,記錄儀。

1. 3 實(shí)驗(yàn)方法

1. 3. 1 小鼠骨骼肌線粒體的制備 將小鼠斷頭處死取腓腸肌,剪碎后電動(dòng)勻漿器勻漿, 差速離心分離線粒體。分離介質(zhì)為0. 25 mol/L蔗糖, 1mmol / L EDTA , 5 mmol / L Tris - HCl(pH7.4) 。所有操作均在 4℃以下進(jìn)行。1. 3. 2 線粒體復(fù)合物 I 活性的測(cè)定 參考 Schneider[1]的方法。反應(yīng)體系中含 Tris - Hcl 緩沖液(p H7. 5) ,10 mmol / L 正鐵氰化鉀, 15 nmol / L NADH ,記錄 410 nm 處吸光度的下降值。酶活性以每毫克蛋白計(jì)算,摩爾消光系數(shù)為 1 030。

1. 3. 3 線粒體復(fù)合物 IV 活性的測(cè)定 通過極譜氧電極法測(cè)定密閉反應(yīng)體系中氧飽和度的變化, 確定氧的消耗量, 以計(jì)算樣品中酶的活性。反應(yīng)體積1. 6 ml , 25℃恒溫, 反應(yīng)介質(zhì)為10mmol / L磷酸鈉,pH 7. 4 ,4. 5 mmol / L抗壞血酸,2. 7 mmol / L四甲基- 對(duì)苯二胺鹽酸鹽( TEMPD) ,1 mmol / L 細(xì)胞色素 C。開動(dòng)磁力攪拌器,待平衡后將線粒體懸液注入反應(yīng)室,記錄儀曲線下降,根據(jù)記錄儀走紙的格數(shù)來計(jì)算酶的活力,酶活力以每秒內(nèi)每分子細(xì)胞色素 C轉(zhuǎn)移的電子數(shù)(e - / s. heme a)為單位。1. 3. 4 統(tǒng)計(jì)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由 Excel 統(tǒng)計(jì)軟件處理 , 以x ±s表示,t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

結(jié)果表明,對(duì)照組隨著小鼠年齡的增長(zhǎng),骨骼肌線粒體復(fù)合物 I (NADH脫氫酶) 活性顯著下降, 復(fù)合物 IV (細(xì)胞色素氧化酶)活性無明顯變化。經(jīng)過8個(gè)月運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練的小鼠骨骼肌線粒體復(fù)合物 I 及復(fù)合物 IV 活性明顯升高, 顯著高于同齡對(duì)照鼠甚至高于 5月齡鼠。

3 討論

研究證實(shí)線粒體呼吸鏈上的某些酶是由線粒體DNA (mtDNA)和核DNA (nDNA)共同編碼的。由于 mt DNA 特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及所處的位置 (線粒體內(nèi)膜,自由基產(chǎn)生的主要來源) 所以mt DNA很容易受到自由基損傷, 又缺乏較完善的修復(fù)機(jī)制 ,從而引起損傷積累,造成呼吸鏈酶的缺陷,影響氧化磷酸化功能[2 ,3 ],許多研究證實(shí),mt DNA 突變隨增齡而升高,氧化磷酸化能力隨增齡而下降。許多研究表明, 線粒體的老化是細(xì)胞衰老的重要原因之一, 隨著年齡的增加, 線粒體結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常, 由線粒體功能下降引起的細(xì)胞能量缺損可能消弱細(xì)胞活性和細(xì)胞適應(yīng)各種生理應(yīng)激的能力。缺血性實(shí)驗(yàn)對(duì)線粒體呼吸鏈活性的影響發(fā)現(xiàn),復(fù)合物 I為最脆弱部分。有實(shí)驗(yàn)表明,在衰老進(jìn)程中,橫紋肌中細(xì)胞色素氧化酶活性顯著下降[ 4 ]。該酶活性下降與線粒體產(chǎn)生的氧化物的增加相關(guān)。進(jìn)一步的研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)線粒體細(xì)胞色素氧化酶進(jìn)行性和隨機(jī)的喪失與年齡相關(guān)的線粒體RNA 合成的下降有密切關(guān)系。NADH 脫氫酶有 7個(gè)亞單位是由線粒體 DNA (mtDNA) 編碼的 , 占總的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的59. 2 % , 復(fù)合物 IV 的 3個(gè)亞單位占 24. 4 %也是由 mtDNA 編碼的[ 5 ]。由于 mtDNA 在胞內(nèi)的位置及其結(jié)構(gòu)特性,決定了它易受線粒體氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基的攻擊, 引起 mtD2NA 的突變。尤其是隨著年齡的增長(zhǎng),組織中抗氧化劑隨增齡而減少時(shí) , 體內(nèi)積累的氧化損傷作用即可導(dǎo)致線粒體和 mtDNA的變異,從而使氧化磷酸化反應(yīng)減退。氧化磷酸化缺陷時(shí),可嚴(yán)重威脅各種器官和組織的能量需求和正常運(yùn)轉(zhuǎn), 從而產(chǎn)生臨床癥狀和老化相關(guān)性疾病。也正基于此, Wallace 等提出了 mtD2NA 突變導(dǎo)致衰老和老年退化病的假說[6 ]。近期有關(guān)運(yùn)動(dòng)與衰老的研究表明, 運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高衰老大鼠線粒體基質(zhì)酶及呼吸酶活性[7 ,8 ]。Tate 等人的研究表明衰老大鼠心肌細(xì)胞色素氧化酶活性與成年大鼠相比明顯下降, 8～10周跑臺(tái)訓(xùn)練后,該酶活性顯著提高[8 ]。衰老個(gè)體線粒體酶活性的提高直接反映了線粒體功能的改善。本研究通過對(duì)小鼠長(zhǎng)達(dá) 8個(gè)月的訓(xùn)練 , 發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌線粒體復(fù)合物 I活性無影響,但卻使復(fù)合物 IV 活性明顯升高。由此可見,運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練在一定程度上致骨骼肌線粒體功能產(chǎn)生適應(yīng)性變化。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)骨骼肌線粒體抗氧化能力的研究結(jié)果 (另文發(fā)表)分析, 長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性的升高, 及時(shí)清除氧自由基, 減少其對(duì)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)及脂類的氧化損傷,mtDNA 結(jié)構(gòu)的完整有利于其編碼的酶活性的表達(dá)。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 骨骼肌線粒體呼吸鏈活性隨增齡而逐漸下降, mtDNA突變率卻逐漸升高, 推測(cè)體細(xì)胞隨增齡而出現(xiàn) mtDNA 突變是呼吸鏈酶活性下降的可能原因之一。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高mtDNA編碼的 mRNA (細(xì)胞色素 b ,復(fù)合物IV亞單位I ,復(fù)合物I亞單