Dr. Zhiping 與 Dr. Ami Citri合作，在操控人類胚胎和出生后的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成功能性的神經(jīng)元細(xì)胞（iN）的研究中取得突破性研究進(jìn)展。

 

- 單細(xì)胞基因表達(dá)

 

- Biomark系統(tǒng)

- 48.48動(dòng)態(tài)微流體整合芯片

 

美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院以轉(zhuǎn)化開創(chuàng)性醫(yī)學(xué)研究為病人提供優(yōu)質(zhì)護(hù)理而聞名。Dr. Zhiping（原分子和細(xì)胞生理學(xué)系博士后）和Dr. Ami Citri（精神病和行為學(xué)系博士后）結(jié)合他們的努力，與其他研究人員一道在Nature Protocols雜志上發(fā)表了題為Induction of human neuronal cells by defined transcription factors, Nature; and also Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells的文章。這篇文章和其他的相關(guān)操作流程描述了他們?nèi)绾螌⒏杉?xì)胞和產(chǎn)后皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)（腦）細(xì)胞的工作。Dr Pang 說：“這些工作不僅在利用細(xì)胞模型研究人類神經(jīng)疾病方面邁出了重要的一步，而且也將對(duì)解讀表觀遺傳學(xué)如何調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的分化和成熟提供重要的參考。”

 

作者在文中測(cè)試了兩種假設(shè)：1）確定強(qiáng)制性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子是否可誘導(dǎo)人類多能干細(xì)胞獲得神經(jīng)元細(xì)胞特性，2）非神經(jīng)元的人成纖維細(xì)胞是否也可被轉(zhuǎn)換成神經(jīng)元。Citri博士說：“zhiping來找我，他需要這個(gè)項(xiàng)目能夠在單細(xì)胞水平上評(píng)估細(xì)胞群落中的多樣性�！彼�說：“要評(píng)估轉(zhuǎn)換成神經(jīng)細(xì)胞的效率，成熟細(xì)胞的水平以及轉(zhuǎn)化后獲得特定的神經(jīng)細(xì)胞的屬性都是理解從其他細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元細(xì)胞的基礎(chǔ)。因此我們建立了一個(gè)流程，利用Fluidigm的動(dòng)態(tài)整合微流體芯片來評(píng)估單個(gè)神經(jīng)元。我們從一組相對(duì)大量的單細(xì)胞樣品中，檢測(cè)了一套膠質(zhì)生物標(biāo)記、神經(jīng)元標(biāo)記或成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物以評(píng)估神經(jīng)元的轉(zhuǎn)換過程的效率和特異性。我們從小鼠神經(jīng)元細(xì)胞開始，嘗試著檢測(cè)從Fluidigm公司平臺(tái)獲得的數(shù)據(jù)的質(zhì)量情況，但它的有效性立即讓我們吃了一驚�！�

 

Dr Zhiping Pang在編寫這篇文章及本報(bào)告中提到的流程時(shí)是斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子和細(xì)胞生理學(xué)系博士后。目前他是新澤西州兒童健康研究所和羅伯特·伍德·約翰遜醫(yī)學(xué)院的神經(jīng)科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系助理教授。他的工作重點(diǎn)是研究肥胖癥。

 

Dr Ami Citri博士是在斯坦福大學(xué)的精神病學(xué)和行為科學(xué)系做博士后的時(shí)候進(jìn)的行這項(xiàng)研究。 2012年夏天，他將擔(dān)任耶路撒冷的希伯來大學(xué)的高級(jí)講師（助理教授）。他的工作重點(diǎn)是在成癮癥的研究。

 

Dr Citri 認(rèn)為：“Fluidigm的方法效力非常巨大，我?guī)缀醪粫?huì)再回頭去使用傳統(tǒng)的定量PCR方法了�！�

 

在他們的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，為了確定在人類多能干細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子是否可誘導(dǎo)神經(jīng)元的屬性，在未分化的人類胚胎干細(xì)胞（ES）中轉(zhuǎn)染了Brn2，ASCL1和myt1l（作者稱為“BAM”）與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）。經(jīng)過處理后，他們觀察到雙極類神經(jīng)細(xì)胞及成熟的神經(jīng)元形態(tài)，并表達(dá)典型的神經(jīng)元細(xì)胞TUBB3和MAP2蛋白。電生理分析顯示，這些細(xì)胞產(chǎn)生了動(dòng)作電位。因此BAM因素可在人類干細(xì)胞中誘導(dǎo)出神經(jīng)細(xì)胞的的差異。在他們的第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，他們想了解非神經(jīng)元人成纖維細(xì)胞是否也可以被直接轉(zhuǎn)換成神經(jīng)元。他們用BAM因素+ NEUROD1轉(zhuǎn)染初級(jí)人類胎兒成纖維細(xì)胞系（HFFs）。這些因素可產(chǎn)生成熟的神經(jīng)元細(xì)胞，表達(dá)神經(jīng)絲蛋白，及體現(xiàn)神經(jīng)元的一些表征過程，包括具有synapsin and synaptotagmin（兩個(gè)突觸囊泡蛋白）染色陽性。因此，BAM+NEUROD1因素可誘導(dǎo)非神經(jīng)元人成纖維細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞分化。

 

使用Fluidigm公司的48.48動(dòng)態(tài)芯片進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)分析。通過簇電極(patch electrodes)抽取收集生長(zhǎng)在培養(yǎng)皿中的單細(xì)胞，并噴出到CellsDirect™緩沖液（Invitrogen）中，然后快速冷凍直到下一步工序。解凍的細(xì)胞進(jìn)行特定目標(biāo)的逆轉(zhuǎn)錄和18個(gè)循環(huán)的PCR進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增（STA）。 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在BioMark系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析。為確保特異性的擴(kuò)增，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中包含梯度滴定的人腦總RNA，并只對(duì)表現(xiàn)出線性擴(kuò)增的引物進(jìn)行分析。此外，對(duì)單細(xì)胞和對(duì)照RNA的PCR產(chǎn)物熔解曲線進(jìn)行比較，以確保PCR產(chǎn)物的特異性。BioMark系統(tǒng)為驗(yàn)證免疫熒光和電生理的表型數(shù)據(jù)提供了另一層面的數(shù)據(jù)。這些研究人員在Nature protocols雜志上發(fā)布了他們的實(shí)驗(yàn)路程：Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells。Dr Pang說：“當(dāng)人們談?wù)撘詡鹘y(tǒng)的方式做單細(xì)胞PCR時(shí)，我從來沒有留下深刻的印象。這是低通量的，他們不能運(yùn)行驗(yàn)證測(cè)試。但有了Fluidigm公司的技術(shù)，我們可以使有多個(gè)內(nèi)部對(duì)照，我們可以確定一個(gè)實(shí)驗(yàn)是否能工作。該系統(tǒng)給了我們完美的結(jié)果。真正讓我感到驚訝的是，當(dāng)我們重復(fù)了其中一個(gè)芯片的實(shí)驗(yàn)，我們得到幾乎相同的結(jié)果，所以它是高度可重復(fù)的。我們認(rèn)為，在神經(jīng)科學(xué)界的其他人可能有興趣做這方面的工作。因此，我們寫了這個(gè)操作流程的文章并被雜志接受�！�

 

雖然這些研究人員主要使用的的BioMark系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)元的研究，他們說，他們相信其他領(lǐng)域的研究也可以受益于這項(xiàng)技術(shù)。 “任何需要進(jìn)行細(xì)胞群落在單細(xì)胞水平的多樣性的研究、及任何受起始原料限制的領(lǐng)域，這都將是富魯達(dá)技術(shù)發(fā)揮巨大效應(yīng)的地方�！盋itri博士說�！斑@可以是人的活組織切片檢查，或因?yàn)槠鞴偬�小而從少量的組織中開始首次實(shí)驗(yàn)，也可以是任何應(yīng)用激光捕獲的顯微切割樣品，或提取的一個(gè)非常明確的細(xì)胞群體�！�

 

Dr Pang說：“單細(xì)胞基因表達(dá)分析適用于許多領(lǐng)域，包括細(xì)胞生物學(xué)和神經(jīng)學(xué)。當(dāng)有異質(zhì)性的細(xì)胞群，細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄的識(shí)別就變得非常重要�！痹谶@個(gè)研究之后，這兩個(gè)科學(xué)家已經(jīng)接受了在各自新的研究機(jī)構(gòu)的學(xué)術(shù)職位，但他們都打算繼續(xù)使用富魯達(dá)的平臺(tái)進(jìn)行單細(xì)胞的研究。

 

“Fluidigm的方法效力是如此的巨大，我?guī)缀醪粫?huì)再回頭去使用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的定量PCR方法�！盌r. Citri說�！斑@是非常有用的，因?yàn)樗�讓我用高效率和低成本的方式�?yàn)證微芯片(microarray)數(shù)據(jù)。當(dāng)我在各種應(yīng)用中檢測(cè)大量的基因時(shí)，我不需要每次用微芯片來處理樣品。我可以用富魯達(dá)公司的微流體芯片用數(shù)百個(gè)探針研究很多樣本。從原始的微芯片實(shí)驗(yàn)中我已經(jīng)創(chuàng)建了一個(gè)候選基因和定量PCR探針數(shù)據(jù)庫。此外，有效地利用最小的樣品量，可以讓我把我的樣品作成一個(gè)文庫，每當(dāng)一組新的基因成為我的興趣焦點(diǎn)時(shí)我可以不斷對(duì)他們進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)我來說，這是Fluidigm公司系統(tǒng)的巨大優(yōu)勢(shì)之一�！�

 

Dr Pang在2011年11月開始在新澤西州兒童健康研究所和羅伯特•伍德•約翰遜醫(yī)學(xué)院的神經(jīng)科學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)系擔(dān)任助理教授進(jìn)行獨(dú)立科研工作。

 

“我實(shí)驗(yàn)室的研究重點(diǎn)是：研究從干細(xì)胞到大腦的突觸調(diào)節(jié)機(jī)制。我有興趣了解肥胖人的食物攝入行為是如何被身體的激素和神經(jīng)肽改變的�！彼�說， “一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，在下丘腦區(qū)域有一組神經(jīng)元表達(dá)瘦素（leptin）受體，但它們對(duì)瘦素的反應(yīng)有很大差異。我推斷下丘腦不同的細(xì)胞有不同的基因表達(dá)模式，這些只能用單細(xì)胞基因表達(dá)譜來解析。我的另一個(gè)研究方向是用人的成纖維細(xì)胞或多能性干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)細(xì)胞，用這作為細(xì)胞模型來研究人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病。單細(xì)胞的基因分析將是在我的實(shí)驗(yàn)室中研究這些突觸調(diào)控會(huì)使用的主要技術(shù)之一。”

 

“任何需要進(jìn)行細(xì)胞群落在單細(xì)胞水平的多樣性的研究、及任何受起始原料限制的領(lǐng)域，這都將是富魯達(dá)技術(shù)發(fā)揮巨大效應(yīng)的地方�！�

— Dr. Citri博士