1. 用TBS和PBS稀釋的蛋白樣品，好的稀釋方法是由樣品中的抗原稀釋濃度決定的，但是由于抗原的濃度是未知的，所以有必要進(jìn)行寬范圍的稀釋度的檢測(cè)。SuperSignal West Pic化學(xué)發(fā)光底物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)皮g水平，所以樣品的稀釋范圍可以從微克水平到皮克水平。如果要使用過多的抗原，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)以下情況：非特異性條帶、模糊條帶和信號(hào)降低；

 

2. 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)印膜。所需膜的數(shù)量依賴于被屏蔽的一抗和/或二抗有多少種不同稀釋濃度。通常，一種或兩種一抗的稀釋度是用兩種或三種不同的二抗稀釋度進(jìn)行測(cè)定的。例如：1/1000的一抗和1/50000的二抗；1/1000的一抗和1/100000的二抗；1/5000的一抗和1/50000的二抗；以及1/5000和1/100000的二抗；

 

3. 將膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點(diǎn)在膜上。用盡可能小量的稀釋液點(diǎn)在膜上（2-5 ul為宜），因?yàn)橛玫捏w積越大，信號(hào)越彌散。抗原溶液在膜上干10-30分鐘或直至無可見的水分；

 

4. 用含0.05%的Tween-20封閉液封閉膜上的非特異性點(diǎn)，室溫震蕩孵育1 h；

 

5. 將一抗稀釋到封閉液/Tween-20去污劑中，并加到膜上，室溫震蕩孵育1h；

 

6. 用TBS或PBS洗膜4-6次，用盡可能大體積的洗脫液，在洗脫液中加入0.05%的吐溫，用以減少非特異背景。每次洗脫過程中，使膜懸浮在洗脫液中震蕩大約5分鐘，倒出洗脫液并重復(fù)。孵育前，在洗脫液中短時(shí)間的漂洗可能會(huì)增加洗脫效率；