自WillhelmRoux于1885年從雞胚中分離細胞首次建立體外細胞培養(yǎng), 單層細胞培養(yǎng)技術已有百余年的歷史。一個多世紀以來,單層細胞培養(yǎng)有了蓬勃的發(fā)展, 特別是在制藥或者疫苗合成等產(chǎn)業(yè)化領域, 通過細胞的快速分裂,從而高效率地制造產(chǎn)品。但在生命科學基礎研究領域, 對于細胞的體外培養(yǎng), 關注的不僅僅是它們的分裂生長,而更為重要的是它們經(jīng)過傳代后能否維持體內(nèi)的性狀。在很多情況下, 單層細胞培養(yǎng)技術所取到的研究結果和體內(nèi)的情況不符合,因為細胞在體外改變的環(huán)境下增生, 逐漸喪失了原有的性狀。動物實驗完全在體內(nèi)進行,但由于體內(nèi)的多種因素制約以及體內(nèi)和外界環(huán)境相互影響而變得復雜化, 難以研究單一過程。另外, 我們在動物身上所觀察到的結果,往往是最終呈現(xiàn)的表現(xiàn), 而非研究者最為關心的中間過程。顯然, 如何填補單層細胞培養(yǎng)和動物實驗的鴻溝,一直是生命科學家思索的問題。尤其是在發(fā)育生物學領域, 迫切需要建立一套細胞培養(yǎng)技術, 既能生長傳代, 還能最大程度地維持體內(nèi)性狀,并分化產(chǎn)生新的組織結構, 以便全面研究發(fā)育過程。隨著組織工程的新興發(fā)展, 三維細胞培養(yǎng)技術就應運而生了。

 

體外細胞培養(yǎng)的一個重要原則是需模擬體內(nèi)細胞生長環(huán)境,該模擬系統(tǒng)中最重要的核心因素是細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細胞培養(yǎng), 三維細胞培養(yǎng)技術(three-dimensional cell culture, TDCC)是指將具有三維結構的不同材料的載體與各種不同種類的細胞在體外共同培養(yǎng), 使細胞能夠在載體的三維立體空間結構中遷移、生長,構成三維的細胞-載體復合物。三維細胞培養(yǎng)是將細胞培植在一定的細胞外基質(zhì)中, 細胞外基質(zhì)( extracellular matrix,ECM) 蛋白充當生長支架, 使得細胞能夠分化產(chǎn)生一定的三維組織特異性結構, 所創(chuàng)建的細胞生長環(huán)境,則最大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境。TDCC作為體外單層細胞系統(tǒng)的研究與組織器官及整體研究的橋梁,顯示了它既能保留體內(nèi)細胞微環(huán)境的物質(zhì)及結構基礎,又能展現(xiàn)細胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。近幾年三維細胞培養(yǎng)技術在組織形成、血管發(fā)育和器官再造等發(fā)育生物學的分支領域得到了廣泛的應用;同時在篩選新藥的療效分析和毒理實驗方面, 利用三維培養(yǎng)獲得了和二維單層培養(yǎng)完全不同的結果, 引起了藥物學家的極大興趣。

 

細胞賴以生存的三維空間，其功能是為細胞提供生存空間，使細胞獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)進行氣體交換，并使細胞按預制形態(tài)的三維支架生長，成為使細胞生長良好的三維界面。理想的生物支架材料應具備以下特點：良好的生物相容性、可降解性、足夠的孔隙結構、促進細胞黏附與增殖、具備承載生長因子的能力、支架的容積應能保持不變、支架能與周圍組織融為一體、不易從缺損區(qū)脫落、具有一定的彈性、具有關節(jié)軟骨的分層結構。常用的支架材料有：天然生物材料、人工合成高分子材料、無機材料以及這些材料的復合物。

 

天然生物材料主要包括：膠原、明膠、纖維蛋白、殼聚糖、瓊脂、糖胺多糖(如：透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等)、藻酸鹽、蠶絲蛋白、松質(zhì)骨骨基質(zhì)、脫細胞基質(zhì)等。天然支架的優(yōu)勢在于有利于細胞包埋，抗原性低、無毒性、無致炎性、能促進細胞生長和粘附等。但天然材料的缺點是機械性能差，一方面不適應塑性的需要，另一方面，在體內(nèi)水解過程中不能保持空間構型并且吸收過快，其應用受到限制。再者，天然材料每批之間都有差別，難以大批量加工生產(chǎn)。

 

目前，市場上商品化的三維支架產(chǎn)品多以Matrigel、膠原復合物為主。膠原是天然蛋白質(zhì)的一種，廣泛存在于動物的皮膚、骨、軟骨、牙齒、肌脾韌帶和血管中，占人體蛋白質(zhì)總量的30%以上，是結締組織極重要的結構蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護機體的功能。膠原一般是白色透明、無分支的原纖維，它的周圍是由多糖和其他蛋白質(zhì)構成的基質(zhì)。膠原蛋白分子肽鏈上具有多種反應基團，如羥基、羧基和氨基等，易于吸收和結合多種酶和細胞，實現(xiàn)固定化，它具有與酶和細胞親合性好、適應性強的特點。膠原具有重要的生物學性質(zhì)——力學性能高、促進細胞生長、止血、生物相容性和生物降解性。已有報導，膠原可以作為移植載體用于骨介入蛋白——骨形態(tài)基因蛋白2(rhBMP2)的載運。膠原現(xiàn)已被廣泛應用于作為傳送培養(yǎng)好的皮膚細胞和藥物的載體，以進行皮膚替代和燒傷治療。另外膠原是一種成膜性好的物質(zhì)，并具有生物相容性，在體內(nèi)可被逐步吸收，因此，膠原蛋白固定化酶特別適合于人工應用材料。但其同時也存在某些缺點，諸如難以規(guī)模制備，機械強度較差，對感染部位的療效不顯著等。商品化的膠原復合物支架有牛皮、雞爪等來源。Matrigel是從小鼠腫瘤組織中提取的抽提物, 這為三維培養(yǎng)介導的針對人體的干細胞臨床治療帶來了風險。

 

目前常用的無機材料有羥基磷灰石、磷酸鈣骨水泥、磷酸三鈣等，此類材料主要應用于骨骼組織工程。

羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是人體和動物骨骼的主要成分,這種材料的研究歷史久遠。HA脆性大、抗壓性能比骨組織小，雖然植入體內(nèi)后，由于組織、細胞的侵入，其強度會逐漸升高達到松質(zhì)骨強度，但是有研究人員認為HA在體內(nèi)吸收過慢，不利于愈合的骨骼承受應力和新骨形成。同羥基磷灰石相似，磷酸三鈣(tricalciumphosphate,TCP)具有良好的生物相容性及可吸收性，但是缺乏孔隙、顆粒較小、易分解（6周）、脆性大及不耐壓等缺點，限制了其應用。用磷酸鈣、碳酸鈣、磷酸三鈣為原材料在室溫下發(fā)生系列聚合反應合成磷酸鈣骨水泥（calciumphosphatecement,CPC），這種化學復合物的晶體結構與天然骨相似，可以塑形，有良好的骨形態(tài)和力學特點，能夠提供機械完整性。其孔隙率大約為50%，與羥基磷灰石相似，但脆性大，其降解時間較長，約需2年左右。另一方面，磷酸鈣骨水泥材料內(nèi)部的孔隙直徑小于1mm，成骨速度慢，目前的研究重點是如何將其與大孔隙材料復合以提高吸收速度及加快成骨。

 

總的來說，此類材料具有較高的壓縮強度、耐磨性和化學穩(wěn)定性，并可在生物體內(nèi)發(fā)生降解，被新生骨組織吸收和替代，是骨組織支架常使用的材料。但存在多孔體強度較差、加工困難、形成的支架孔隙率低、脆性大、組織不能完全長入等缺點。

 

人工合成高分子材料可以通過分子設計等手段精確的控制其性質(zhì)，也可以通過化工生產(chǎn)得到大批量性質(zhì)基本相同的產(chǎn)品。相對于天然材料，更利于進行標準化的生產(chǎn)，力學強度也較好，但是生物相容性還有待提高，目前比較常用的辦法是通過表面修飾在材料表面引入生物活性因子。合成高分子材料包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯等脂肪族聚酯，這類聚合物具有良好的可塑性，可通過模塑、擠壓、溶劑澆鑄等技術加工成各種結構形狀，但也存在缺點：①親水性差，細胞吸附力較弱。②易引起無菌性炎癥的發(fā)生，同時聚合物降解易引起局部pH值下降。③機械強度不足。④其它：殘留有機溶劑的細胞毒作用，以及可能引起的纖維化及與周圍組織的免疫反應等問題。

 

目前，在人工合成的高分子材料中，PLGA的應用及研究最為廣泛。其具有良好的生物降解性及生物可吸收性，它的結構通式為[-OCH(R)CO-]，體內(nèi)降解的最終代謝產(chǎn)物為C02和H20，不在體內(nèi)蓄積，沒有毒副作用，能決定新生組織、器官的形狀，為細胞提供獲取營養(yǎng)、氣體交換、廢物排除的環(huán)境，為細胞增殖繁衍提供空間，在美國已獲FDA批準并應用于臨床。PGA具有高降解速度、PLA具有高強度及PLGA具有低降解速度和高藥物透過性等特點，故可以在高分子設計的基礎上合成一系列具有不同降解速度及力學性能聚和物，通過對材料組分、組成比、分子量、分子量分布等的控制，可以調(diào)節(jié)材料的生物降解速度在幾周至幾年間變化。

 

雖然人工合成的可降解高分子材料本身對細胞親和力弱，往往需要引入適量能促進細胞黏附和增殖的活性基團、生長因子或黏附因子等。但其降解速度和強度可以調(diào)節(jié)，易構建高孔隙率三維支架。同時相比較天然生物材料，其可以在常溫下保存，更簡單且易操作。

 

日前，由美國3DBiotek公司新進研究出一款由聚己內(nèi)酯（PCL）合成的可生物降解的三維支架，該材料已被應用于許多美國FDA批準使用的外科植入物當中。相較其他人工合成的高分子三維支架，此款三維細胞培養(yǎng)產(chǎn)品具有100%的孔隙聯(lián)通性，以及可以精確控制的孔徑和孔隙結構，使不同批次產(chǎn)品具有高度的一致性。另一方面，此款產(chǎn)品具有較好的抗壓性，細胞可在其上進行很好的增殖、分化，是適合市場需求的一款簡單易用型3D培養(yǎng)產(chǎn)品。

 

3.1 組織工程     

組織工程(TissueEngineering)是近年來正在興起的一門新興學科，“組織工程”一詞最早是由美國國家科學基金會1987年正式提出和確定的，即：應用生命科學和工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的結構與功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)生物替代。組織工程的核心為：建立細胞與生物材料的三維空間復合體，即具有生命力的活體組織，用來對病損組織進行形態(tài)、結構和功能的重建并達到永久性替代。

 

成熟的軟骨細胞和干細胞被廣泛用于三維細胞培養(yǎng)，以再生損傷的軟骨、骨、韌帶、肌腱和膝關節(jié)半月板。在培養(yǎng)系統(tǒng)中常加入一些生長因子，以刺激分化，產(chǎn)生組織。Spitzer將兔造骨前體細胞在附有7.5％磷酸三鈣(alpha-TCP)的血纖維蛋白內(nèi)培養(yǎng)53天，用無alpha-TCP組作對照，結果顯示這種系統(tǒng)能有利于體外骨的形成。Quarto等報道了應用自體骨髓間充質(zhì)干細胞和羥基磷灰石構建的組織工程化人工骨修復骨缺損獲得了成功。國內(nèi)也有人以I型膠原及殼聚糖制備出適于組織工程皮膚構建的三維支架，其從大鼠皮膚中分離出具有穩(wěn)定生物學性狀的真皮成纖維細胞(Fibroblasts，F(xiàn)bs)種植在該支架中進行聯(lián)合培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)組織工程皮膚構建過程中，種子細胞與三維多孔支架間的相互作用類似于體內(nèi)正常組織中細胞-細胞外基質(zhì)間的動態(tài)相互作用。

 

利用三維技術模擬天然的心臟復雜結構仍然是醫(yī)學難題，在最新的研究中，美國明尼蘇達大學心血管修復中心的Doris  Taylor教授和同事采取了脫細胞化的方法，使用天然心臟的脫細胞基質(zhì)做為平臺制造人工心臟。研究人員首先將大鼠和豬心臟中的細胞全部移除，只留下細胞外基質(zhì)做為三維支架，向其中注入新生大鼠心臟“祖細胞”（progenitor  cells），在實驗室中進行體外培養(yǎng)，成功制成了大鼠和豬的人工心臟。四天后，觀測到收縮；八天后，新心臟開始搏動。全球患有心力衰竭等嚴重心臟疾病的人數(shù)以萬計，每年有大量的患者因得不到合適的捐贈心臟而死亡，這一成果有望為人類人工心臟制備提供新的方法，而且由于新心臟里充滿了受者的細胞，所以產(chǎn)生排異反應的幾率也會降低。此次研究也意味著應用三維培養(yǎng)技術也許可以人工制造任何器官，腎、肝、肺、胰腺等。

 

腫瘤細胞在一定時間、空間條件下具有特定表型，表現(xiàn)為特殊的結構和生長行為，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。上世紀七八十年代，科學家開始認識到微環(huán)境對腫瘤表型起著重要作用。通過研究腫瘤細胞生長的微環(huán)境可以認識特定基因改變與腫瘤細胞惡性表型間的關系。

 

傳統(tǒng)二維細胞培養(yǎng)只能在二維平面上對細胞進行基因操作，可以了解到特定基因改變對細胞生物學行為的影響，卻不能準確反應腫瘤發(fā)生的形態(tài)學特點。動物模型雖然可以準確地反映腫瘤發(fā)生的形態(tài)學特點，但難以進行大規(guī)模的基因操作研究，同時也不能對中間的發(fā)生過程進行實時觀察。三維細胞培養(yǎng)結合了二維細胞培養(yǎng)和動物模型的優(yōu)點，在體外構建與體內(nèi)相近的細胞發(fā)育結構系統(tǒng)。因而三維細胞培養(yǎng)除可以模擬腫瘤細胞在體內(nèi)生長微環(huán)境之外，還可以高通量地研究特定基因改變與細胞表型的關系及其生物學行為的變化過程。

 

三維培養(yǎng)細胞技術的先行者之一——Bissell等利用該技術成功地構建了乳腺癌上皮細胞培養(yǎng)模型，并在乳腺癌的研究中取得重大進展。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外基質(zhì)及其整聯(lián)蛋白家族受體決定了乳腺上皮細胞的表型，這種作用超過了細胞的基因型對細胞表型的影響。來源于同一種系的正常乳腺上皮細胞S-1和成瘤細胞T4-2在二維培養(yǎng)條件下，兩種細胞在形態(tài)和生長速度上差別不大。然而，在三維再造基底膜上培養(yǎng)時，S-1細胞呈現(xiàn)完整的腺泡樣結構，而T4-2細胞則形成巨大的、排列松散、紊亂的侵襲性克隆。當對T4-2細胞克隆群進行B1-整聯(lián)蛋白抗體干預實驗，發(fā)現(xiàn)T4-2細胞克隆惡性表型被完全逆轉，而且這種表型變化是可逆的，二維培養(yǎng)則無此結果。由此可見，三維細胞培養(yǎng)模型能輔助判斷和選擇特定抑制劑及其組合，以最有效地抑制特定分型的癌細胞的生長，可應用于腫瘤特異性化療藥物的設計，殺死癌細胞或阻止腫瘤的進展。

 

腫瘤細胞所處的微環(huán)境對腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用。在體內(nèi)，腫瘤細胞通過細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)間的信號傳遞維持腫瘤的生長。三維細胞培養(yǎng)技術能模擬體內(nèi)細胞與細胞間以及細胞與細胞外基質(zhì)間信號傳遞的微環(huán)境，還可以通過技術的改進實現(xiàn)多種細胞的共培養(yǎng)及其與細胞外基質(zhì)的聯(lián)系。盡管在乳腺癌的研究中，三維培養(yǎng)模型比較成熟，但理論上每一種組織、每一種器官都具有各自獨特的微環(huán)境。

 

干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞群體。近年來，生物學家們已經(jīng)逐漸意識到：就細胞群體間所具有的生理及病理性作用而言，僅通過二維培養(yǎng)體系很可能會喪失一些寶貴的生物學信息。目前，許多研究已集中于三維培養(yǎng)，利用組織工程和基因工程技術對干細胞進行體外誘導和人工操作，對組織細胞損傷性疾病的替代治療的研究備受關注。但值得指出的是，諸多報道所采用的研究體系均局限于二維平面培養(yǎng)體系，而實際上干細胞在體內(nèi)的生長、分化微環(huán)境應為三維化體系。大量資料表明，干細胞的分化發(fā)育及其發(fā)育方向，取決于其所處的微環(huán)境(microenvironment)。越來越多的研究已表明，只有體外三維培養(yǎng)體系才能更好的模仿干細胞的在體生長模式，才可能為組織工程研究提供更為科學、完整的實驗數(shù)據(jù)。

 

魏國峰等嘗試在體外構建了一種能實現(xiàn)胚胎干細胞生長、分化的三維細胞模型，在該模型中以液態(tài)膠原為支架，小鼠胚胎干細胞(ESCs)為細胞模型，構建了ESCs-膠原復合體。結果表明ESCs在該膠原條帶所提供的三維培養(yǎng)體系內(nèi)不但能夠保持良好的生長、增殖狀態(tài)，而且彼此間能建立細胞連接，從而形成結構、功能統(tǒng)一體。其還對該膠原條帶內(nèi)ESCs能否自發(fā)性分化為心肌細胞進行了初步檢測。結果表明：ESCs在膠原條帶內(nèi)能夠分化產(chǎn)生心肌細胞。這些ES源心肌細胞的肌小節(jié)結構已經(jīng)發(fā)育成熟，接近于新生鼠心肌細胞的結構。由此可見，三維培養(yǎng)體系不但能支持ESCs的增殖與分化行為，而且還利于分化細胞間彼此建立細胞連接，從而促進其組織化發(fā)育。

 

三維培養(yǎng)體系可以更為真實的模擬在體干細胞的生長方式，而由此所獲取的相關信息將會為哺乳動物發(fā)育生物學的相關研究提供更為科學、詳實的實驗數(shù)據(jù)。

 

在三維培養(yǎng)技術的發(fā)展過程中，探索更好的生物材料至關重要，細胞在支架上的生長、移植和內(nèi)生長率直接依賴于支架的多孔結構、孔隙率、孔的直徑和孔的形狀。高孔隙率提供細胞生長的足夠空間并可促使工程化組織毛細血管網(wǎng)的形成，以滿足其對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。連通的孔也是組織內(nèi)生長、血管形成和養(yǎng)分供應的必須�？椎倪B通道必須大于100um，否則組織僅能侵入植入物的表面且組織內(nèi)不易得到充分的養(yǎng)料。目前為止，仍然沒有一種支架能完全同時滿足目的細胞的黏附、增生、浸潤、持續(xù)分化以及提供足夠的機械性能，并滿足在體內(nèi)支架降解和基質(zhì)生成相一致的要求。為促進三維培養(yǎng)技術的發(fā)展和應用，2003年10月美國國家癌癥研究院設立專門基金研究細胞微環(huán)境，計劃投入數(shù)千萬美元用于發(fā)展三維培養(yǎng)技術。針對不同的組織、不同的應用，具體什么樣的空間結構更有效，是否有更好的生物支架材料還有待進一步研究。