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羅氏454高通量測序平臺(tái)的特點(diǎn)及應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：7038　發(fā)布日期：2011-6-8　來源：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司

Genome Sequencer FLX (GS FLX)系統(tǒng)是羅氏454 公司的第二代測序臺(tái)，GS FLX的命名正是來源于其在多領(lǐng)域的靈活(flexible)應(yīng)用。隨著該系統(tǒng)性能和應(yīng)用領(lǐng)域的不斷提升和擴(kuò)展，必將帶動(dòng)整個(gè)測序領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展，對(duì)大規(guī)�；蛐蛄醒芯康南嚓P(guān)應(yīng)用領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的推動(dòng)作用。美吉生物以先進(jìn)的羅氏454高通量測序平臺(tái)、專業(yè)的科研團(tuán)隊(duì)、個(gè)性化的實(shí)驗(yàn)方案，為您打造優(yōu)質(zhì)的高通量測序服務(wù)。

Genome Sequencer FLX System

型號(hào)：GS FLX System

試劑：long-read GS FLX Titanium chemistry

產(chǎn)量：100萬序列∕Run

讀長：400bp以上

應(yīng)用：基因組de novo測序、轉(zhuǎn)錄組de novo測序、宏基因組測序、重測序

貢獻(xiàn)：應(yīng)用此技術(shù)已經(jīng)發(fā)表1026篇學(xué)術(shù)論文

發(fā)展： 2011年將實(shí)現(xiàn)測序讀長達(dá)到1000bp

測序原理

GS FLX系統(tǒng)的測序原理是基于焦磷酸測序法，依靠生物發(fā)光對(duì)DNA序列進(jìn)行檢測。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下，GS FLX系統(tǒng)將引物上每一個(gè)dNTP的聚合與一次熒光信號(hào)釋放偶聯(lián)起來。通過檢測熒光信號(hào)釋放的有無和強(qiáng)度，就可以達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。此技術(shù)不需要熒光標(biāo)記的引物或核酸探針，也不需要進(jìn)行電泳；具有分析結(jié)果快速、準(zhǔn)確、高靈敏度和高自動(dòng)化的特點(diǎn)。

GS FLX高通量測序方法原理示意圖

實(shí)驗(yàn)流程

GS FLX系統(tǒng)減少了傳統(tǒng)測序樣品制備過程中對(duì)大型自動(dòng)站的依賴，完全不需要進(jìn)行繁瑣的建庫過程，也不必進(jìn)行克隆挑取、微孔板處理等工作，利用創(chuàng)新的磁珠和emPCR技術(shù)進(jìn)行樣品制備，同時(shí)提供完整的后續(xù)生物信息學(xué)分析解決方案。

1) 樣品種類：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品序列測定，包括基因組DNA，PCR產(chǎn)物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同類型的樣品測序都可在一臺(tái)儀器上完成。

2) 樣品DNA打斷：樣品如基因組DNA或BAC等被打斷成300-800bp的片段；對(duì)于小分子的非編碼RNA，這一步驟并不需要。短的PCR產(chǎn)物則可利用GS融合引物擴(kuò)增后直接進(jìn)行步驟4)。

3) 加接頭：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將3′端和5′端有特異性的A和B接頭連接到DNA片段上。接頭也將在后繼的純化，擴(kuò)增和測序步驟中用到。圖中僅僅顯示了后續(xù)步驟中要用到的單鏈的DNA片段。

4) 一條DNA片段＝一個(gè)磁珠：接頭使成百上千條DNA片段分別結(jié)合到一個(gè)磁珠上，磁珠被單個(gè)油水混合小滴包被后，在這個(gè)小滴里進(jìn)行獨(dú)立的擴(kuò)增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響；所有DNA片段進(jìn)行平行擴(kuò)增(emPCR)。

5) 一個(gè)磁珠＝一條讀長：經(jīng)過emPCR擴(kuò)增后，每個(gè)磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬個(gè)相同的拷貝。經(jīng)過富集以后，這些片段仍然和磁珠結(jié)合在一起，隨后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后繼測序使用了。

6) 數(shù)據(jù)讀取和分析工具：GS FLX 系統(tǒng)提供三種不同的生物信息學(xué)工具對(duì)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，適用于不同的應(yīng)用。例如多達(dá)3GB序列的重測序，對(duì)比已知參考序列進(jìn)行的擴(kuò)增產(chǎn)物差異分析及 120MB的從頭測序工作等。

技術(shù)應(yīng)用

1.全基因組測序

u 多達(dá)120 Mb的未知基因組的測序

1）生成基因組結(jié)構(gòu)概圖

2）研究DNA序列的組織，分布和信息

3）基因篩查：尋找新基因，定位和功能

4）其他基因組進(jìn)行比較研究

u 全基因組進(jìn)行從頭鳥槍法測序，例如微生物基因，BAC和YAC克隆測序

u 比較基因組研究

1）識(shí)別單堿基突變

2）識(shí)別突變熱點(diǎn)和保守區(qū)域

3）識(shí)別插入或者缺失的基因

4）斷定基因型和表型之間的相關(guān)關(guān)系（如研究藥物抗性的遺傳基礎(chǔ)）

5）基于基因測序變化進(jìn)行毒性預(yù)測

6）進(jìn)行流行病學(xué)分析

7）了解工業(yè)生產(chǎn)菌株和它們的親代菌株序列上的差異作為進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)菌株開發(fā)的遺傳基礎(chǔ)

8）進(jìn)行宏基因組(Metagenomics)研究

9）古代化石DNA 測序研究

u 利用配對(duì)末端方法(Pair-End Tag)將Contigs拼接成Scaffolds

2.轉(zhuǎn)錄組和基因調(diào)節(jié)研究

u 基于短Tags，ESTs，ChIP或者GIS-PET序列的高通量轉(zhuǎn)錄組分析，或miRNA序列的基因組范圍識(shí)別，小分子和非編碼RNA的測序

u 研究DNA的甲基化模式來進(jìn)行基因調(diào)節(jié)的研究

3.擴(kuò)增產(chǎn)物分析

u PCR產(chǎn)物的超精細(xì)測序（應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的重測序）

1）在混合的腫瘤樣本中識(shí)別體細(xì)胞突變

2）在群體水平上發(fā)現(xiàn)高可信度的SNP位點(diǎn)

u 環(huán)境微生物物種多樣性深度分析

技術(shù)優(yōu)勢

² Genome Sequencer FLX Titanium 系列

GS FLX測序儀應(yīng)用升級(jí)后的Titanium系列試劑，突破性地實(shí)現(xiàn)了第二代測序既確保了每個(gè)序列的高質(zhì)量、高讀長，又兼顧了高通量測序的特性。應(yīng)用廣泛而穩(wěn)定，在基因組de novo測序、基因組重測序、目標(biāo)基因捕獲測序、宏基因組測序和RNA測序分析等研究領(lǐng)域發(fā)表了上千篇學(xué)術(shù)論文。

² 獲得更全面的數(shù)據(jù)

每次運(yùn)行能產(chǎn)生100萬條以上的有效序列，以Q20為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，單序列讀長在400bp以上，只需耗時(shí)10小時(shí)。

² 提升項(xiàng)目實(shí)施能力

應(yīng)用GS FLX平臺(tái)可以在一次實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)長序列讀長測序和大片段雙末端測序的完美結(jié)合，一次性實(shí)驗(yàn)即可完成一個(gè)微生物基因組的de novo測序項(xiàng)目，且能確保最佳拼接效果。

² 降低實(shí)驗(yàn)成本

400bp以上的讀長和超高通量測序能力，使實(shí)驗(yàn)效果最大化，實(shí)驗(yàn)成本最小化�？梢愿鶕�(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求靈活選擇測序通量，保證了測序能力的充分利用，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)節(jié)約。

² 提高實(shí)驗(yàn)效率

標(biāo)準(zhǔn)化流水作業(yè)的文庫構(gòu)建流程，避免了常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)菌轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)以及單克隆的挑選。emPCR富集全自動(dòng)工作站使實(shí)驗(yàn)人員從繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作中解放出來。² 提供簡單易用的生物信息處理軟件

提供生物信息解決方案如GS De Novo Assembler，GS Reference Mapper，and GS Amplicon Variant Analyzer，使測序數(shù)據(jù)的處理得心應(yīng)手。

系統(tǒng)屬性

l Titanium 系列試劑

Titanium 系列試劑在試劑、耗材和軟件方面都進(jìn)行了優(yōu)化，確保了GS FLX卓越的測序性能。

GS FLX Titanium series performance

Throughput	400-600 million high-quality， filter-passed bases per run* 1 billion bases per day
Run Time	10 hours
Read Length	Average length = 400 bases
Accuracy	Q20 read length of 400 bases (99% at 400 bases and higher for prior bases)
Reads per run	>1 million high-quality reads
Data	Trace data accepted by NCBI since 2005
Computing Requirements	Cluster recommended (Roche GS FLX Titanium Cluster available)
Robustness	No complex optics or lasers, reagents have long shelf life

測序結(jié)果舉例：（平均讀長、序列數(shù)取決于樣品特性）

GS FLX測序儀

測序儀全貌測序儀內(nèi)部構(gòu)造

l GS FLX高通量測序儀規(guī)格參數(shù)

Dimensions: upper assembly	74.3 cm W × 69.8 cm D × 36.1 cm H (29.25 in W × 27.5 in D × 14.2 in H) including monitor 82.5 cm (32.5 in) H
Dimensions: lower assembly	75.2 cm W × 90.8 cm D × 92.7 cm H (29.62 in W × 35.75 in D× 36.5 in H)
Weight	242 kg (532 lbs)
Power supply	85 - 132 Vac 50/60Hz 173 - 264 Vac 50/60Hz
Noise level	<65 dB(A)
Electromagnetic emission	Class A Important: This is a Class A device. In residential areas， this device may cause radio interference. The user should take the necessary precautions, if appropriate.
Electromagnetic immunity	Important: In industrial areas， this device may be influenced by radio interference. The user should take the necessary precautions, if appropriate.