一種快速有效的基因分型斑馬魚的方法

       為了促進(jìn)斑馬魚的高通量的基因分型，我們開發(fā)了一種新的技術(shù)——用高通量熔解分析（HRMA）區(qū)分野生、雜合、純合突變。這種耗時一個小時的技術(shù)不需要進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和瓊脂糖凝膠電泳的操作。此技術(shù)生成的熔解圖的敏感性高，可以檢測不明確的PCR產(chǎn)物。我們可以對斑馬魚的三種類型的突變進(jìn)行可靠的基因分型，包括apchu745（apcmcr）和p53zy7 （p531166T ），小的缺失突變（bap28y75）及逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入突變（wdr43hi821a）。這種技術(shù)可對單個斑馬魚胚胎及個體進(jìn)行基因分型并適用于其它類型的生物體。Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。
關(guān)鍵詞：熔解曲線   斑馬魚  基因分型  SNP  點(diǎn)突變  插入突變

簡介
       斑馬魚作為有機(jī)體遺傳模型正在成熟。考慮到比較容易維持大量的突變線，且大量的魚位于每個突變線，大規(guī)模的基因分型需要有效的高通量的基因分型技術(shù)。突變的多種類型導(dǎo)致斑馬魚突變，增加了基因分型的復(fù)雜性。ENU誘變劑——誘導(dǎo)斑馬魚突變的主要物質(zhì)，經(jīng)常導(dǎo)致單個堿基的突變，小的缺失插入也會發(fā)生。第二種比較普遍的方式是插入誘變，用逆轉(zhuǎn)錄病毒插入或轉(zhuǎn)座因子插入破壞基因。因此，有效的基因分型這些突變類型的方法是必須的。
       提供一種更快、有效、令人滿意的基因分型方法，有100%的精確度。尋找高通量的技術(shù)/方法，去除掉比較浪費(fèi)時間的步驟。隨著擴(kuò)增基因組DNA 的PCR技術(shù)的出現(xiàn)，典型的基因分型技術(shù)包括Southern印跡法和放射性方法（RFLP和SSCP）已經(jīng)逐漸被淘汰。一些基于PCR的方法用于偶然產(chǎn)生或消除限制性內(nèi)切點(diǎn)的突變。大多數(shù)方法，除了測序方法之外，需要用PCR產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳。當(dāng)數(shù)百個或成千上萬個樣品需要基因分型時，這項工作就變得浪費(fèi)時間且費(fèi)用較高。
       對于產(chǎn)生或消除一個特殊的限制性位點(diǎn)的突變而言，以PCR為基礎(chǔ)的限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是一種有用的技術(shù)。在這個實驗中，設(shè)計PCR引物擴(kuò)增感興趣的范圍。PCR產(chǎn)物用合適的內(nèi)切酶消化，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化產(chǎn)物。根據(jù)純合突變、雜合突變和純合野生型的限制形式進(jìn)行基因分型。
       衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（dsCAPS）與RFLP相似，限制的消化模式用于決定基因型。不同的是在PCR引物中引入多個錯配，所以額外的錯配，在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中產(chǎn)生一個特殊的限制性位點(diǎn)。接著，用瓊脂糖凝膠電泳檢測消化的PCR產(chǎn)物，再根據(jù)相應(yīng)的限制消化形式進(jìn)行基因分型。但是這技術(shù)有自身的缺點(diǎn)，不完全消化導(dǎo)致的錯誤的基因分型（如：純合突變誤判為雜合突變）。另外，需要的限制性內(nèi)切酶一般很少且很貴。
        等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）是另外一種基于PCR的方法。進(jìn)行兩次PCR反應(yīng)，用2條不同的上游引物，其中一條對野生型等位基因特定的，另外一條是對突變特定的。在這種情況下，一條引物3’端的核苷酸與野生型的點(diǎn)突變相一致，另外一條引物3’端的核苷酸與突變的序列相一致。這種錯配序列的擴(kuò)增和退火細(xì)節(jié)取決于這種方法的特異性。這種方法的缺點(diǎn)是，由于PCR過程中的錯誤擴(kuò)增，造成假陽性的情況比較復(fù)雜。
       逆轉(zhuǎn)錄病毒突變（或插入其他外源DNA序列比如說轉(zhuǎn)座因子）根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒插入位點(diǎn)或野生型DNA的PCR擴(kuò)增的特異性來進(jìn)行基因分型。這些PCR反應(yīng)可以單獨(dú)進(jìn)行，一個反應(yīng)做野生型等位基因，另外一個做突變，也可以做多重PCR。在這種情況下，用的是同一個上游引物。兩個不同的下游引物，一條退火成逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA，另一條退火成野生型DNA。多重PCR反應(yīng)中，設(shè)計PCR引物，使野生型等位基因和突變型產(chǎn)物大小不同，在瓊脂糖凝膠電泳上可以檢測出來。如果PCR反應(yīng)成功，純合突變在瓊脂糖凝膠電泳上可見一條突變產(chǎn)物，雜合動物有兩個產(chǎn)物，純合野生型動物可見一個野生型產(chǎn)物。這種技術(shù)非常精確，但是因為長的PCR反應(yīng)而比較浪費(fèi)時間，另外需要瓊脂糖或其他高分辨的凝膠劑檢測。
        如果沒有提供上述技術(shù)，DNA測序也是動物基因分型的一種選擇。在這種情況下，在感興趣范圍的側(cè)翼區(qū)設(shè)計引物，并擴(kuò)增PCR。通過對PCR產(chǎn)物測序顯示個體動物的基因型。這種分型方法避免了瓊脂糖凝膠電泳的檢測。然而，測序所用的時間及費(fèi)用是這項技術(shù)的缺陷。
        高分辨率熔解曲線分析（HRMA）是分析PCR產(chǎn)物的齊次方法，不需要PCR反應(yīng)之后的操作。其應(yīng)用包括篩查突變、基因分型及序列匹配。主要應(yīng)用于人類，最近報道了這些技術(shù)。
       我們開發(fā)了一種有效、精確基因分型斑馬魚的方法，可以檢測多種類型的突變。我們用一種快速有效，不需要瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法進(jìn)行了兩個堿基對的替換、一個缺失和一個逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入的基因分型。這種方法用高分辨率熔解分析方法分離胚胎或個體魚的純合突變，雜合子及純合野生型。

結(jié)果
       為了克服現(xiàn)有基因分型技術(shù)的缺陷，需要從以下3個方面改進(jìn)：（1）去掉效率低且昂貴的限制性內(nèi)切酶。（2）去掉對瓊脂糖凝膠電泳或其他PCR之后操作步驟的需要，但是保持區(qū)別非特異性產(chǎn)物的能力。（3）增加目前基因分型的速度。高分辨率熔解曲線分析方法符合上述3個要求。
        HRMA用的是敏感性高的成像儀器（我們實驗用的是Lightscanner），在一定溫度范圍內(nèi)量化DNA雙鏈。通過使用一種依賴DNA的熒光化學(xué)物質(zhì)——LC Green染料來量化DNA雙鏈，此染料與雙鏈DNA緊密結(jié)合且發(fā)光。LC Green染料與其它燃料如Sybr-Green 相比，可以用于DNA的飽和濃度而不抑制PCR反應(yīng)，能夠產(chǎn)生高敏感性的熔解曲線。隨著樣品的加熱，不斷的檢測熒光的發(fā)射。一旦達(dá)到特定DNA飽和雙鏈的熔解溫度，可以檢測到熒光信號的劇烈下降。獲得派生的熔解曲線，且在y軸描述每單位（-dF/dT）熒光信號隨著橫坐標(biāo)x軸溫度的增加的的陰性改變。小的變化，甚至是單核苷酸多態(tài)性，在DNA雙鏈的熔解溫度上發(fā)生改變。在此，我們應(yīng)用HRMA方法對兩個缺失突變，一個小的缺失和一個病毒插入突變進(jìn)行分型。
        這種技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶，瓊脂糖凝膠電泳，且因為PCR產(chǎn)物小于60bp，整個PCR反應(yīng)及熔解分析在1小時之內(nèi)完成。另外，PCR產(chǎn)物的特異性可以由熔解曲線的一致性決定，比如說，如果在PCR反應(yīng)中有污染，會顯示額外的熔解峰。提供Lightscanner軟件可在10分鐘內(nèi)自動分析數(shù)據(jù)。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測
       ENU是正向遺傳學(xué)通用的誘變劑，ENU引起的最普通的突變是單個堿基對的改變，引起單核苷酸多態(tài)性，區(qū)分野生型和突變等位基因。我們區(qū)分了斑馬魚線的一個p53突變——p53zy7，此突變經(jīng)由ENU誘變F3正向遺傳學(xué)篩查。此突變是T→C轉(zhuǎn)化在基因的DNA結(jié)合范圍生成I166T。因為p53zy7/zy7突變純合突變線是完全可見的且沒有形態(tài)學(xué)的不同，因此分子基因分型斑馬魚個體是必要的。首先，對包括突變的范圍進(jìn)行測序是區(qū)分基因型唯一可靠的方法。為發(fā)展一種高通量的鑒定突變的方法，HRMA開發(fā)了針對這些位點(diǎn)進(jìn)行基因分型的技術(shù)。我們用Lightscannrt引物設(shè)計軟件設(shè)計包括突變位點(diǎn)（Fig.1A）的引物。整個的PCR產(chǎn)物是39個堿基對。一般而言，PCR產(chǎn)物越小，Tm值的差異越大。但是，在點(diǎn)突變或小的缺失的情況下，Tm值的差異受序列改變的較大限制，而不是引物設(shè)計。野生型和突變DNA雙鏈的單個堿基對的不同造成野生型和突變等位基因之間的Tm值相差近1.5℃。為了檢測以上所述的情況，我們從雜合交叉的魚個體中準(zhǔn)備了48個尾部修飾的DNA樣品。根據(jù)這些樣品的PCR產(chǎn)物生成的熔解曲線，我們觀察到純合野生和純合突變的斑馬魚的熔解曲線的形狀不同（Fig.1B）。明顯的，我們的protocol參數(shù)允許評價雜合度。PCR程序結(jié)束時，加熱樣品至95℃使DNA變性，之后快速冷卻形成異源雙鏈核酸分子。因此，除了有中間的Tm（野生型和突變同源雙鏈之間是～80℃），雜合子有較低的Tm產(chǎn)物，這是因為異源雙鏈的不穩(wěn)定性。
用另一個錯譯的等位基因驗證這項技術(shù)，同時檢測這項技術(shù)是否可以有效的用于晶胚的基因分型，我們從側(cè)翼設(shè)計引物有一個T—C的錯配突變在apchu745（apcmcr）（Hurlstone et al., 2003)。PCR產(chǎn)物是53bp，預(yù)計純合野生型和突變之間有Tm值有1.5℃的差異（表1C）。從雜合晶胚中得到48個DNA樣品。再次進(jìn)行溶解曲線分析，結(jié)果產(chǎn)生了三種不同的溶解曲線（表1D）。在這種情況下，該突變等位基因有胞嘧啶核苷酸，因此，有較高的Tm值，因此，雜合樣品產(chǎn)生了一個中間的同源雙鏈峰和一個異源雙鏈峰。
 
 
Fig.1. 應(yīng)用HRMA對p53zy7（p53I166T）和apchu745（apcmcr）進(jìn)行點(diǎn)突變基因分型。A：p53I166T 錯譯突變周圍的序列。有下劃線的為引物序列，星號標(biāo)注的是SNP位點(diǎn)。野生型產(chǎn)物的Tm值為79.5℃，突變型為80.9℃。B：Melting curves of the PCR products from 48 tail-clip genomic DNA samples isolated from the adult progeny from a cross of p53zy7/þ heterozygotes. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.C：apchu745錯譯突變周圍的DNA序列，下劃線標(biāo)注的是引物序列，星型標(biāo)注的是SNP位點(diǎn)。野生型產(chǎn)物的Tm值是80.9℃，突變的為82.0℃。D：Melting curves of the PCR products from 48 embryonic DNA samples generated by crossing a apchu745/t fish to apchu745/t fish. Following clustering analysis, the red curves denote wild-type samples, the blue
curves denote mutant samples, and the black curves denote heterozygous samples.

      p53基因型（12野生型：24雜合子：12突變型）和APC基因型（11野生型：25雜合子：12突變型）符合孟德爾的1:2:1的比率。此外，通過對p53的24個樣品以及APC的24個樣品進(jìn)行測序，也驗證了HRMA的結(jié)果的準(zhǔn)確性是100%。

缺失檢測
    除了SNP的檢測，我們還想評估是否HRMA可以提供斑馬魚小缺失的基因分型。斑馬魚突變體的bap28的第2外顯子有5個堿基對的缺失（Azuma et al.,2006）。在缺失的側(cè)翼設(shè)計引物，結(jié)果產(chǎn)生46bp的野生型產(chǎn)物和41bp的突變產(chǎn)物，二者的Tm值有1.6℃的差異（表2A）。分析48個DNA樣品，每一個代表一個雜合—雜合的胚胎，產(chǎn)生了三種不同的溶解曲線（表2B）。在這個分析中，較少的純合突變產(chǎn)物的Tm值較低，雜合子表現(xiàn)出中間的Tm值產(chǎn)物和異源雙鏈的產(chǎn)物。和p53以及APC的基因分型相似，BAP28的基因型（12野生型：25雜合子：11純合突變）的比符合孟德爾的1:2:1的遺傳比率，而且24個不同的基因型都通過測序進(jìn)行了驗證。

Fig.2. 通過溶解曲線進(jìn)行bap28突變小的缺失的基因分型。A：bap28缺失突變周圍的DNA序列。下劃線標(biāo)注的是引物序列，虛線標(biāo)注的是缺失。野生型產(chǎn)物的Tm值是76.8℃，突變型為75.2℃。B：從bap28y75/+雜合子得到的48個晶胚的PCR產(chǎn)物的溶解曲線。聚類后，紅色曲線表示野生型樣本，藍(lán)色曲線表示突變型樣本，黑色為雜合樣本。

轉(zhuǎn)錄病毒插入檢測
       斑馬魚的插入誘變是一種常見的也是一種有效的研究基因打斷的方法（Golling et al., 2002; Balciunas and Ekker,2005）。我們想設(shè)計一種方法驗證HRMA是否可以用于斑馬魚的特異性插入的基因分型。該突變系hi821a（Amsterdam et al., 2004）在wdr43基因的第二內(nèi)含子有一個逆轉(zhuǎn)錄病毒的插入（表3A）。設(shè)計引物產(chǎn)生一個小的產(chǎn)物，用Tm值來區(qū)分野生型和突變的等位基因（表3B）。分析插入突變的引物設(shè)計比點(diǎn)突變的引物設(shè)計更加靈活；目的是設(shè)計的PCR產(chǎn)物有更大的Tm的差異。理想情況下，臨近插入位點(diǎn)的引物都可以用于PCR產(chǎn)物，盡量減小兩個產(chǎn)物的同源序列。對于hi821a等位基因，正向引物（插入位點(diǎn)在基因內(nèi)區(qū)2,50）包括突變和野生型等位基因。引物只針對野生型和插入突變設(shè)計，因此，產(chǎn)物有不同的大小和不同的溶解溫度。對于hi821a位點(diǎn)，野生型等位基因內(nèi)含子2的反向引物，在插入位點(diǎn)30，插入突變的反向引物接近逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的50末端（表3A）。因此，純合野生型或突變都只有一個產(chǎn)物和一個Tm值（表3C）。雖然引物A和B或A和C2在理論上都能擴(kuò)增得到突變等位基因的產(chǎn)物，大片段的產(chǎn)物（7+ KB）隨著延伸時間的縮短（4sec），選擇性的擴(kuò)增各產(chǎn)物。此外，在這種情況下，較大的產(chǎn)物可能被擴(kuò)增，這一產(chǎn)物的Tm值可能會高并且易于在分析中排除。在雜合子中多有的產(chǎn)物都被擴(kuò)增。這些產(chǎn)物有截然不同的溶解溫度，三種不同的基因型很容易檢測到（表3C）。值得注意的是，在分析插入突變時一個重要的步驟是PCR反應(yīng)的最后一步?jīng)]有加熱到95℃，而且加了一步72℃的延伸以確保只形成同源雙鏈。Wdr43的基因分型（12野生型：24雜合子：12突變型）遵循孟德爾定律。所有24個基因型都通過PCR引物擴(kuò)增野生型等位基因（583bp）和突變等位基因（230bp），然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證。
 
Fig.3. 通過高分辨溶解曲線進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒插入突變wdr43hi821a進(jìn)行基因分型。A：wdr43hi821a的基因組。B：野生型和突變等位基因的DNA序列。下劃線標(biāo)注的是引物序列。野生型的Tm值為73.0℃，突變型的Tm值為81.1℃。C：從wdr43hi821a/+得到的48個晶胚的DNA樣品的PCR產(chǎn)物的溶解曲線。聚類后藍(lán)色的為野生型樣本，紅色曲線為突變樣本，黑色為雜合樣本。

討論
      通過高分辨溶解曲線（HRMA）很容易就區(qū)分出了斑馬魚中三種不同類型的突變。與其他方法相比該技術(shù)有許多優(yōu)點(diǎn)。所用的時間和PCR所必備的程序明顯少于其他方法。PCR可以快速進(jìn)行，而且溶解曲線的分析要快于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。無需使用稀有的和昂貴的限制性內(nèi)切酶。PCR的有效性和特異性高，可以去除進(jìn)行下游分析的不確定性，例如進(jìn)行酶切就容易出錯。
盡管我們在斑馬魚中應(yīng)用了該技術(shù)，HRMA還可以用于其他模式生物中。從任何生物中得到的DNA都可以進(jìn)行HRMA。大多數(shù)小鼠的基因分型都要敲除等位基因，這里也可以用HRMA這種方法進(jìn)行基因分型以及插入突變的分析。SNP/小缺失檢測的方法可以用于檢測不太頻繁的小鼠missense or floxed的等位基因。類似于斑馬魚，線蟲（C.eleagans）和(D.malanoganster)主要突變的點(diǎn)突變，小的缺失或插入。此外，本研究中描述的這種方法需要從任何生物中提取DNA。因為高分辨溶解曲線分析的靈敏度可以允許檢測單核苷酸的差異，因此通過掃描整個基因可以找到突變的位置。大的人類基因例如BRCA1（van der Stoep et al., 2009）和CFTR（Montgomery et al., 2007）通過掃描的方法比測序要更有效。人類（Liew et al., 2004）和植物（McKinney et al., 2009）的基因分型以及微生物物種分析都可以應(yīng)用。
       TILLING這項技術(shù)曾應(yīng)用于斑馬魚中經(jīng)過ENU誘變的特定基因的突變鑒定（Till et al., 2003）。這一技術(shù)涉及到使用稀有的，異源雙鏈分子特異性酶Cell1的酶切，來檢測不配對的DNA，隨后還要進(jìn)行凝膠切割和成像。這種方法不僅繁瑣而且需要昂貴的設(shè)備。類似于人類突變的掃描，其他基因也可以使用HRMA技術(shù)掃描得到可靠的結(jié)果而且要比TILLING花費(fèi)少且節(jié)省時間。
       該技術(shù)的一個限制就是要使用LightScanner。不過也可以在靈敏度較低的一起上進(jìn)行HRMA，例如Roche LightcycleVR480或Qiagen Rotor-Gene Q，只要PCR產(chǎn)物可以容納總夠的Tm值差異。此前發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示不同的儀器可以不同靈敏度下檢測PCR產(chǎn)物的溶解差異(Herrmann et al., 2006, 2007a,b; Reed et al., 2007)。HRMA的應(yīng)用范圍將繼續(xù)增加（Vossen et al., 2009）。該技術(shù)已經(jīng)成為我們實驗室進(jìn)行動物模型基因分型最有效的方法，并且在突變掃描方面也是非常有價值的技術(shù)。

實驗方法

DNA提取
晶胚或Tail-clip放置于96孔板中，去除晶胚中的水，然后在每個孔中加入100µL的ELB（10mM TRIS pH8.3, 50mM KCl, 0.3% Tween 20, 0.3% NP40, 1 mg/mL  Prot K）,55℃培養(yǎng)4hr 至過夜，這根據(jù)樣品的大小決定。板95℃加熱15min已鈍化蛋白酶K。

PCR和溶解曲線分析
引物設(shè)計，HRMA可以依據(jù)不同純合擴(kuò)增子Tm值得差異來區(qū)分不同的基因型（Liew et al., 2004）。這種差異可以使用任何一種軟件包的鄰近參數(shù)來估算Tm值。除此之外，引物設(shè)計沒有特定的要求，使用任何引物設(shè)計軟件都可以。點(diǎn)突變的引物設(shè)計可以使用Lightscanner引物設(shè)計軟件（Idaho Technology）。然而對于小的缺失或插入，可以手動設(shè)計引物，然后使用Vector NTI程序來預(yù)測產(chǎn)物的Tm值（Invitrogen）。PCR可以在MJ Research 96孔PCR儀上進(jìn)行。所有的反應(yīng)使用96孔板（BioRad HSP9665）。SNP檢測和小的缺失的PCR反應(yīng)程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 2sec（40 cycles）。之后95℃ 10sec,4℃冷卻，4℃保存。逆轉(zhuǎn)錄病毒插入檢測的PCR反應(yīng)程序是：95℃ 15sec，然后95℃ 2sec，60℃ 2sec，72℃ 4sec（35cycles），隨后72℃ 30sec，4℃冷卻，4℃保存。PCR試劑：1×ExTAQ PCR buffer，1× dNTPs（250 µM each），1× LC Green Plus，0.5µM 引物，1µL 基因組DNA，0.25U ExTAQ，10µL反應(yīng)體系。PCR結(jié)束后在LightScanner上65-95℃進(jìn)行溶解曲線分析（Idaho Technology）。升溫速率為0.1℃/sec。使用LightScanner軟件進(jìn)行溶解曲線的歸一化后進(jìn)行分析（Wittwer et al., 2003）�；�因分型全部由軟件自動化完成（Palais and Wittwer, 2009）。96孔板的溶解大概需要10min，基因分型不到5min。

PCR引物
• P53 FWD (F3): GCGCCTGCTGGTCA
• P53 REV (F4): CTGATTGCCCTCCACTCTT
• APC FWD (F29): CCACTAATAATGTTGCAGCTGA
• APC REV (F30): GACTGATGATTGGCTCTCAGA
• BAP28 FWD (K73): AAAGAGGTCAACAAGAAACTG
• BAP28 REV (K74): TGAGGAAGAGAGAAATGCTC
• WDR43 FWD (K51): ACAAGATTCTTAAGGGATAAAGT
• WDR43 REV (K56): GTAAATCATCATTAACATCTATTACC
• VIRUS REV (K53): GAGTGATTGACTACCCGTCAG
• WDR43 FWD (SG9): CCATCCTCATCTACAGCACACTGA
• WDR43 REV (SG112): GGGTTAATGGGACCAACTGA
• VIRUS REV (SG22): GTTCCTTGGGAGGGTCTCCTC