用于細(xì)胞培養(yǎng)的微載體

微載體培養(yǎng)（microcarrier culture）是一種用于高產(chǎn)量培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的實(shí)用技術(shù)。CytodexTM專用于培養(yǎng)各類動(dòng)物細(xì)胞，其培養(yǎng)體積可以從數(shù)毫升到6000升以上。應(yīng)用Cytodex微載體技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單的貼壁細(xì)胞懸浮化培養(yǎng)，每毫升培養(yǎng)液可得到數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞。微載體適于搖瓶、轉(zhuǎn)瓶、攪拌罐以及WAVE生物反應(yīng)器等各種培養(yǎng)系統(tǒng)。

 

Cytodex技術(shù)為進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)提供了新的選擇。該微載體為動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了適宜的表面，并可用于懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。還可用于增加單層細(xì)胞培養(yǎng)容器 （例如培養(yǎng)板、 培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶）及灌注室（perfusion chambers）中的細(xì)胞產(chǎn)量。其應(yīng)用范圍為大量生產(chǎn)各類細(xì)胞、病毒及重組細(xì)胞產(chǎn)物（例如，干擾素，酶，核酸，激素）；研究細(xì)胞貼壁、分化及細(xì)胞功能；灌注柱式培養(yǎng)系統(tǒng)（perfusion column culture systems）；顯微鏡檢查研究；獲取有絲分裂細(xì)胞；分離細(xì)胞；膜研究；細(xì)胞的保存和運(yùn)輸，細(xì)胞遷移的檢測(cè)及標(biāo)記化合物的攝取研究。

 

產(chǎn)品特性

Cytodex 的設(shè)計(jì)能夠滿足微載體技術(shù)的特殊需要。

●Cytodex 的大小和密度經(jīng)優(yōu)化處理，以保證培養(yǎng)各類細(xì)胞時(shí)使其生長(zhǎng)良好，產(chǎn)量提高。

●培養(yǎng)基架為生物學(xué)惰性，可為懸浮微載體培養(yǎng)提供堅(jiān)實(shí)而非剛性的培養(yǎng)面。

●微載體透明，可直接使用顯微鏡觀察或染色后觀察。

Cytodex 1以交聯(lián)葡聚糖基架 （cross-linked dextran matrix）為基礎(chǔ)，該基架被帶正電荷的N，N二乙胺基乙基基團(tuán)（N, N-diethylaminoethyl groups）取代。該帶電基團(tuán)遍布于整個(gè)微載體基架中。

 

Cytodex 3含有一層較薄的變性膠原， 與交聯(lián)葡聚糖基架化學(xué)偶聯(lián)。 Cytodex3 上的變性膠原層易被胰蛋白酶和膠原酶等多種蛋白酶消化，因此，能在維持細(xì)胞最大活性、功能和完整性的同時(shí)將細(xì)胞從微載體上分離出來(lái)。

 

關(guān)于如何選擇適合于某種特定應(yīng)用的Cytodex的具體細(xì)節(jié)請(qǐng)參閱 《微載體細(xì)胞培養(yǎng)： 原理與方法》（18-1140-62）手冊(cè)，GE Healthcare可提供本書(shū)。Cytodex1適用于通用微載體培養(yǎng)（general purpose microcarrier culture），尤其適用于大多數(shù)已建立的細(xì)胞系（established cell lines）。在對(duì)培養(yǎng)產(chǎn)物的最大回收率無(wú)要求時(shí)，該微載體也可用于原代細(xì)胞和正常二倍體細(xì)胞系的培養(yǎng)。Cytodex3是用于某些難以生長(zhǎng)的細(xì)胞、分化細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、尤其是具有上皮樣形態(tài)學(xué)特征細(xì)胞的首選微載體。此外，在逐級(jí)擴(kuò)增培養(yǎng)（scaling up）和需要最大限度的保留細(xì)胞活性和膜完整性的簡(jiǎn)單回收細(xì)胞時(shí)，推薦使用該微載體。

 

 

應(yīng)用Cytodex進(jìn)行微載體培養(yǎng)的具體細(xì)節(jié)，請(qǐng)參閱 《微載體細(xì)胞培養(yǎng)： 原理與方法》（18-1140-62）手冊(cè)，GE Healthcare 可提供本書(shū)。

 

準(zhǔn)備工作

干燥的微載體在無(wú) Ca ^2＋和 Mg ^2＋的磷酸緩沖液（PBS）（每克Cytodex加 50-100ml）中在室溫下浸

泡膨脹 至少 3 小時(shí)。棄去上清液，用新配制的無(wú) Ca ^2＋、Mg ^2＋的 PBS（每克 Cytodex 加30-50ml）洗滌微載體數(shù)分鐘。棄去 PBS，換上新的無(wú) Ca ^2＋、Mg ^2＋的 PBS（每克Cytodex 加30-50ml），然后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。Cytodex非常穩(wěn)定，可以反復(fù)（至少5 次）長(zhǎng)時(shí)間（130℃，12h，27psi）進(jìn)行高壓滅菌而不影響其性能。所有溶液的 pH應(yīng)為 7.4。

 

 

Cytodex 也可以用乙醇消毒。 微載體在用無(wú)Ca ²⁺、Mg ^2＋的 PBS 膨脹后沉降，棄去上清液，換上 70％（體積比）的蒸餾水稀釋乙醇。用該溶液洗兩遍微載體，然后移入新的70％的乙醇溶液（每克Cytodex 加 70-100ml）孵育過(guò)夜。然后，移去乙醇溶液，在使用前，Cytodex用無(wú)菌的無(wú)Ca ^2＋、Mg ^2＋PBS（每克Cytodex加50ml）洗 3 遍，用培養(yǎng)基（每克Cytodex加 20-50ml）再洗 1遍。

 

在使用前， 待無(wú)菌的微載體沉降后， 棄去上清液，用預(yù)熱過(guò)的培養(yǎng)基（每克 Cytodex 加 20-50ml）簡(jiǎn)

單地洗1遍微載體。當(dāng)微載體沉降后，倒掉上清液，將微載體轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)容器中。

 

細(xì)胞培養(yǎng)容器

有關(guān)培養(yǎng)容器的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參閱《微載體細(xì)胞培養(yǎng)：原理與方法》手冊(cè)。 簡(jiǎn)而言之，微載體培養(yǎng)液可置于各類細(xì)胞培養(yǎng)容器中。但是，應(yīng)用一些在輕微攪動(dòng)即可使微載體均勻懸浮的容器所獲得的效果最佳，如WAVE生物反應(yīng)器。那些在應(yīng)用了能有效的混合懸液但不產(chǎn)生高剪切力的裝置能夠形成一個(gè)均勻的培養(yǎng)環(huán)境的容器就是進(jìn)行通用微載體培養(yǎng)的最佳容器。在選擇培養(yǎng)容器時(shí)，一定要考慮一些設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如在培養(yǎng)過(guò)程中，攪拌槳不能和容器的內(nèi)表面有任何接觸，否則，就會(huì)破壞微載體。同樣，軸承浸沒(méi)在培養(yǎng)基內(nèi)的旋轉(zhuǎn)式

容器（spinner vessels）也不合適，這樣，微載體可能會(huì)被旋轉(zhuǎn)的軸承擠碎。市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)到各種配套設(shè)計(jì)的系統(tǒng)，選擇哪種系統(tǒng)主要根據(jù)所需培養(yǎng)容器的大小而定。此外，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室，中試（pilot）及大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用還有很多其它培養(yǎng)容器。請(qǐng)聯(lián)系GE醫(yī)療系統(tǒng)集團(tuán)了解更多信息。

 

 

確切的細(xì)胞培養(yǎng)程序取決于細(xì)胞的種類和培養(yǎng)容器。在《微載體細(xì)胞培養(yǎng)：原理與方法》手冊(cè)中對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)

程序有詳細(xì)介紹。根據(jù)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，微載體培養(yǎng)液通常含有1-5克/升的Cytodex，接種5×104-2×105細(xì)胞/毫升， 按20-60rpm速度攪拌。灌注微載體培養(yǎng)液（Perfused microcarrier cultures）可含高達(dá)20

g/升Cytodex。在首次進(jìn)行懸浮微載體培養(yǎng)時(shí)，可參考以下介紹的一種方法。培養(yǎng)液的體積和接種量的大小應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)量的不同做相應(yīng)的調(diào)整。配制100毫升的培養(yǎng)液， 應(yīng)將0.3克的Cytodex溶于30ml培養(yǎng)基中，

加入到旋轉(zhuǎn)式容器。再接種107細(xì)胞于該培養(yǎng)液中，輕輕混勻，37℃孵育。一旦細(xì)胞牢固地貼壁在微載體的表面，即開(kāi)始連續(xù)攪動(dòng)。細(xì)胞貼壁所需要的時(shí)間主要取決于該類細(xì)胞的貼壁效率（attachment efficiency）。如果細(xì)胞貼壁的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要間斷性（例如，每30分鐘攪動(dòng)2分鐘）攪動(dòng)培養(yǎng)液以保證細(xì)胞和微載體的均勻分布。然后，將培養(yǎng)液的容積增加到50毫升。攪拌的速度取決于培養(yǎng)容器，而且要足夠快以防止微載體沉降。1至2天后，培養(yǎng)液體積增加至100毫升，3至5天后，部分培養(yǎng)基需要更換。培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞，該程序可能需要做一些相應(yīng)的調(diào)整。

 

從培養(yǎng)物中提取有代表性的微載體樣本直接用相差顯微鏡檢查或用用蘇木紫染色后在顯微鏡下進(jìn)行檢查。檢

測(cè)細(xì)胞數(shù)量最好的方法是使用標(biāo)準(zhǔn) 的 細(xì) 胞 核 記 數(shù) 法 （ standard  nucleus extrusion method ）。（Sanford， K.K.， Earle , W.R., Evans, V.J. et al., J. Nat. Cancer Inst. 11(1951)773－795）。

 

有多種方法可將細(xì)胞從Cytodex中移出。最常用的方法是使用蛋白水解酶如胰蛋白酶，膠原蛋白酶進(jìn)行消化的標(biāo)準(zhǔn)方法。用胰蛋白酶回收細(xì)胞時(shí)，可使微載體沉降，倒掉培養(yǎng)基，再用pH7.6、含0.02％（質(zhì)量體積比）乙二胺四乙酸（EDTA）的無(wú)Ca ^2＋、Mg ^2＋的PBS洗微載體5分鐘。

 

EDTA-PBS溶液的量應(yīng)按Cytodex  /克加50-100毫升。然后將EDTA-PBS溶液棄去，換上胰蛋白酶-EDTA（Cytodex/克加約30-50毫升）。然后在胰蛋白酶-EDTA溶液中將微載體混勻，37℃孵育，間歇式混合。15分鐘后，加入含血清的培養(yǎng)基（Cytodex/克加20-30毫升培養(yǎng)基）中止胰蛋白酶的作用。此時(shí)，微載體內(nèi)附著的所有細(xì)胞可通過(guò)輕輕的攪動(dòng)脫落下來(lái)。再通過(guò)單位重力（unit gravity）離心沉降（常規(guī)回收法）

或通過(guò)直徑100微米的過(guò)濾器過(guò)濾（回收率最高）將消化下來(lái)的細(xì)胞與微載體分離，分離的細(xì)胞用于接種到

下一輪的微載體培養(yǎng)中（比如，在逐級(jí)放大生產(chǎn)過(guò)程中）。如果用上述EDTA-胰蛋白酶回收方法不能得到滿意的細(xì)胞回收率，可以進(jìn)一步對(duì)消化過(guò)程參數(shù)進(jìn)行仔細(xì)的優(yōu)化，同時(shí)將所使用胰蛋白酶溶液的活性標(biāo)準(zhǔn)化。 請(qǐng)聯(lián)系GE醫(yī)療系統(tǒng)集團(tuán)了解更多信息。

 

游離細(xì)胞懸液。

 

每個(gè)批次的Cytodex都要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的檢驗(yàn)測(cè)定其理化和功能特性。每種細(xì)胞都要培養(yǎng)一周以上的時(shí)間以確保微載體能支持高密度細(xì)胞生長(zhǎng)。所有批次Cytodex產(chǎn)品都可以提供一份含有這些檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量分析證書(shū)（Certifi cate of Analysis），可以來(lái)函索取。

 

供應(yīng)與儲(chǔ)存

Cytodex產(chǎn)品為干燥粉末，在使用前必須水化和滅菌。以下是供貨包裝規(guī)格：

未開(kāi)封的 Cytodex 在干燥條件下儲(chǔ)存，有效期達(dá) 5 年以上，用前述方法水化和滅菌的 Cytodex，可在4℃下、在PBS 中無(wú)菌儲(chǔ)存至少兩年。