陸麗芳，Christain Kaisermayer, 姚鈺舜，隋禮麗

通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部，F(xiàn)ast Trak研發(fā)中心，上海

 

 

    Vero 細(xì)胞能被廣泛應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)。Vero 細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)能否成功放大對(duì)于該技術(shù)能否大規(guī)模應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)至關(guān)重要。作為貼壁細(xì)胞，我們的經(jīng)驗(yàn)證明Vero 細(xì)胞能夠成功地用微載體技術(shù)在 WAVE 反應(yīng)器中生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步尋求放大培養(yǎng)的可能性，我們?cè)?WAVE 反應(yīng)器中進(jìn)行了細(xì)胞從微載體 Cytodex  1 上的球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)。一系列的實(shí)驗(yàn)都相當(dāng)成功。Vero細(xì)胞首先在 10 L的培養(yǎng)袋中用Cytodex 1微載體培養(yǎng)到一定密度，生長(zhǎng)在微載體上的細(xì)胞隨后用胰蛋白酶消化，經(jīng)消化后基本脫離微載體的細(xì)胞最終和舊的微載體根據(jù)一定的傳代密度轉(zhuǎn)移到新的微載體培養(yǎng)體系中并開(kāi)始新一輪細(xì)胞培養(yǎng)。我們的結(jié)果顯示，幾次這樣的轉(zhuǎn)移傳代前后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度基本一致。Vero 細(xì)胞的微載體培養(yǎng)技術(shù)在 WAVE 反應(yīng)器中放大完全可能。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，在現(xiàn)有的工作條件下，Vero細(xì)胞在 Cytodex 上的培養(yǎng)以及球轉(zhuǎn)球工藝可以達(dá)到 10 倍的放大倍率。這為基于細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)新前景提供了可靠的支持。

 

前言

 

    Vero細(xì)胞最初起源于非洲綠猴腎，已知對(duì)多種病毒如 SV40、  SV-5、 麻疹病毒、蟲(chóng)媒病毒、呼吸道腸道病毒、風(fēng)疹、猿腺病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、副流感病毒、牛痘病毒等等，都敏感。Vero 細(xì)胞因而被廣泛應(yīng)用于針對(duì)相應(yīng)疾病的疫苗開(kāi)發(fā)[1]。最近針對(duì)流感疫苗的開(kāi)發(fā)就使用到了 Vero 細(xì)胞[2]。知名的制藥企業(yè)百特公司（Baxter  Healthcare)成功利用 Cytodex3 型微載體進(jìn)行 Vero 細(xì)胞流感疫苗的生產(chǎn)，使用 3 級(jí)不同的發(fā)酵罐進(jìn)行微載體球轉(zhuǎn)球擴(kuò)增，最終至 6000L 反應(yīng)器的培養(yǎng)規(guī)模。諾華公司也早已在其歐洲的細(xì)胞培養(yǎng)工廠(chǎng)中得到許可使用細(xì)胞疫苗生產(chǎn)技術(shù)。諾華公司最近與美國(guó)衛(wèi)生與公共服務(wù)部（HHS)達(dá)成協(xié)議，后者贊助前者 4.86 億美元在北卡羅來(lái)那建立哺乳動(dòng)物細(xì)胞疫苗生產(chǎn)基地，計(jì)劃 2012 年投入使用[3]。細(xì)胞疫苗技術(shù)，具有快速和可靠的特征，作為全球發(fā)展的大趨勢(shì)，將有望逐步替代目前的雞胚疫苗技術(shù)。

       

    作為貼壁細(xì)胞，Vero 細(xì)胞需要生長(zhǎng)于一定的表面，在小規(guī)模狀態(tài)下可以用 T 型培養(yǎng)瓶或滾瓶來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。國(guó)內(nèi)微載體細(xì)胞培養(yǎng)水平和國(guó)外差距較大，多數(shù)仍使用轉(zhuǎn)瓶/細(xì)胞工廠(chǎng)直接接種到 30L 發(fā)酵罐中，采用多個(gè) 30L 發(fā)酵罐平行放大操作。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)屬于勞動(dòng)密集型操作，無(wú)法對(duì) pH、溶氧等參數(shù)進(jìn)行精密控制，同時(shí)具有較高的污染風(fēng)險(xiǎn)。多個(gè)小型發(fā)酵罐的平行放大無(wú)法避免每個(gè)反應(yīng)器之間的差異，增加了生產(chǎn)過(guò)程的控制點(diǎn)，不利于產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和整個(gè)生產(chǎn)工藝的驗(yàn)證，限制了產(chǎn)能。

 

    因此需要開(kāi)發(fā)大規(guī)模微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以滿(mǎn)足生物技術(shù)發(fā)展的需要，而微載體球轉(zhuǎn)球放大工藝就是其中的關(guān)鍵點(diǎn)之一[4,5]，以便在更大的工業(yè)規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)和生產(chǎn)。衡量這一技術(shù)是否成功,  一方面固然是轉(zhuǎn)移是否成功，同樣重要的另一方面則是轉(zhuǎn)移后細(xì)胞是否能有同樣的生長(zhǎng)狀態(tài)。

 

方法

    在10升的細(xì)胞培養(yǎng)袋中，Vero在微載體 Cytodex 1 (Cyt.1)上貼壁培養(yǎng)，微載體濃度是 3-6g/L,懸浮培養(yǎng)體積 1.5-3L。在接種前一天，細(xì)胞培養(yǎng)袋預(yù)先被放置到WAVETM 反應(yīng)器上，充滿(mǎn) 10%  CO2,并加入 70-90%培養(yǎng)體積所需的培養(yǎng)液以及微載體，并在 37°C 搖動(dòng)過(guò)夜以便使溫度和 pH 得到充分平衡。接種當(dāng)天，用胰酶把細(xì)胞從細(xì)胞工廠(chǎng)中消化下來(lái)，重新懸浮于新鮮的培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到預(yù)先平衡的細(xì)胞培養(yǎng)袋中，細(xì)胞接種密度控制在每毫升 3-5x105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)條件是，搖速 11  rpm，角度 4 度，溫度 37°C。pH 控制在 7.0-7.3 之間。根據(jù)葡萄糖的代謝情況適時(shí)通過(guò)用新鮮培養(yǎng)液替換培養(yǎng)袋內(nèi)的培養(yǎng)液來(lái)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。每天采樣監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)速度和狀態(tài)。

 

    細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法是，用含檸檬酸的結(jié)晶紫染色液破碎細(xì)胞，釋放并染色細(xì)胞核，通過(guò)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞核來(lái)確定細(xì)胞的數(shù)量。微載體上的細(xì)胞形態(tài)則通過(guò)固定，蘇木素染色和顯微鏡來(lái)觀(guān)察并照相。細(xì)胞密度達(dá)到約每毫升2-3x106個(gè)時(shí)，進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)。每次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)后，細(xì)胞在WAVETM 反應(yīng)器內(nèi)用上述同樣的方法進(jìn)行數(shù)天的培養(yǎng)，觀(guān)察生長(zhǎng)狀況。

 

    在瓶子內(nèi)進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)

    在 WAVETM 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到需要的水平時(shí)，Vero 細(xì)胞微載體培養(yǎng)懸浮液即被轉(zhuǎn)移到另外一個(gè)透明的瓶子中并移到生物安全柜中。后面的清洗和胰酶消化過(guò)程等均在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。在微載體沉降下來(lái)之后，去除上清。剩下的微載體被轉(zhuǎn)移到 500 毫升無(wú)菌透明的瓶子內(nèi)（這是根據(jù) 2 升培養(yǎng)體積所需的瓶子大小，不同的情況應(yīng)有不同的需求）。盡量多地去除上清。加入 400 毫升 37°C 預(yù)熱的含 0.02% EDTA 磷酸緩沖液  (PBS-EDTA), 適當(dāng)混合，待微載體沉降后去除上清。以上同樣的過(guò)程重復(fù) 3次以使微載體得到充分洗滌。

 

    長(zhǎng)有細(xì)胞的微載體在用 PBS-EDTA 充分洗滌之后，即用含 0.02%  EDTA 的 0.25%胰酶消化。2 升的培養(yǎng)體積（6 克微載體），胰酶用量為 300 毫升。胰酶預(yù)先在37°C 預(yù)熱，在與微載體混合之后置于 37°C 中并每隔 10 分鐘進(jìn)行一次充分的混合。25-30 分鐘之后，根據(jù)所需要的接種密度和稀釋倍數(shù)，取一部分細(xì)胞-微載體-胰酶混合懸浮液到一個(gè)干凈的無(wú)菌轉(zhuǎn)移瓶?jī)?nèi)，與新鮮培養(yǎng)基混合并接種到一個(gè)新的培養(yǎng)袋中開(kāi)始新一輪的培養(yǎng)。在 WAVETM 培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)

 

    在 WAVETM 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度達(dá)到需要的水平時(shí)，球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)在 WAVETM 培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，準(zhǔn)備裝有 5-10 升 PBS-EDTA 的液體轉(zhuǎn)移瓶和溶積 5-10 升的廢液瓶，滅菌。準(zhǔn)備 1 升的液體轉(zhuǎn)移瓶?jī)蓚�(gè)，滅菌，并在無(wú)菌條件下分別裝入胰酶和新鮮培養(yǎng)基。將 PBS-EDTA，胰酶和新鮮培養(yǎng)基分別預(yù)熱至 37°C。

 

    在無(wú)菌條件下（如無(wú)菌管道焊接機(jī)）將這幾個(gè)瓶子與細(xì)胞培養(yǎng)袋接通。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞培養(yǎng)袋均被置于反應(yīng)器上。反應(yīng)器停止搖動(dòng)并停止加熱以防過(guò)熱或不均勻加熱。培養(yǎng)袋內(nèi)長(zhǎng)有 Vero 細(xì)胞的微載體會(huì)在數(shù)分鐘內(nèi)沉到底部。用泵把盡量多的上清液移至廢液瓶。加入一定量的 PBS-EDTA，輕柔混勻后，再次沉降微載體并移去上清。如此重復(fù)三次，每次使用 PBS-EDTA 的量不超過(guò)一個(gè)培養(yǎng)體積。

 

    長(zhǎng)有細(xì)胞的微載體在用 PBS-EDTA 充分洗滌之后，與 37°C 預(yù)熱的含 0.02% EDTA 的 0.25%胰酶混合，在微載體密度為 3g/L 時(shí)，胰酶的用量為 15%培養(yǎng)體積。胰酶的用量可根據(jù)實(shí)際情況作調(diào)整。加入胰酶后的混合液每 10 分鐘輕柔搖動(dòng)混合一次。25-30 分鐘后，細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)的懸浮液被轉(zhuǎn)移至一個(gè)空的無(wú)菌轉(zhuǎn)移瓶?jī)?nèi)。用少量新鮮培養(yǎng)液淋洗培養(yǎng)袋一次并和前面的合并。根據(jù)所需要的接種密度和稀釋倍數(shù)，接種新的細(xì)胞培養(yǎng)袋并開(kāi)始新一輪培養(yǎng)。

 

 

    這里有三次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)（B2B  #1, #2, #3)。其中一次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)(B2B #1)在培養(yǎng)袋外的瓶子中進(jìn)行，另兩次(B2B  #2 和#3)在 WAVETM 培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行。第一次（B2B #1)和第三次(B2B  #3)實(shí)驗(yàn)的 Vero 細(xì)胞來(lái)自通過(guò)細(xì)胞工廠(chǎng)接種到培養(yǎng)袋中并生長(zhǎng)起來(lái)的細(xì)胞，而第二次實(shí)驗(yàn)  (B2B  #2)的 Vero 則直接來(lái)自第一次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)后接種并培養(yǎng)起來(lái)的細(xì)胞。這幾次實(shí)驗(yàn)我們均是在細(xì)胞密度超過(guò) 2x106時(shí)進(jìn)行球轉(zhuǎn)球，并把

放大倍數(shù)控制在 5-6 倍。表 1 列舉的是這三次轉(zhuǎn)移的大致情形。在第一次轉(zhuǎn)移之前，細(xì)胞首先從細(xì)胞工廠(chǎng)接種到 10 升的培養(yǎng)袋內(nèi)并培養(yǎng)生長(zhǎng)到所需要的細(xì)胞密度。經(jīng)過(guò)球轉(zhuǎn)球之后的細(xì)胞培養(yǎng)也是在 10升的培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行。

 

表1.各次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)情況

    每次球轉(zhuǎn)球前后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況都通過(guò)每天采樣來(lái)監(jiān)測(cè)。圖 1 和圖 2 顯示的就是根據(jù)每次培養(yǎng)每天細(xì)胞密度的增長(zhǎng)情況繪制的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。我們把相關(guān)聯(lián)的放在一起做比較。其中圖 1 顯示的是 B2B  #1、B2B  #2 之前和之后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，而圖 2 則顯示的 B2B  #3 之前及之后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。我們可以看到在各次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)前后，細(xì)胞都保持著良好的生長(zhǎng)活力。在球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)之后，因起始細(xì)胞密度相比初始種子培養(yǎng)的稍低，因此需要多一天時(shí)間達(dá)到相似的細(xì)胞密度�？傮w來(lái)說(shuō)，細(xì)胞生長(zhǎng)的速度基本相同。

圖1.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #1和 B2B #2前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖2.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #3前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

 

    圖 3 和圖 4 顯示的是球轉(zhuǎn)球前后 Vero 細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況，分別有接種前第一、第三和第五天細(xì)胞的形態(tài)。圖 4 的上面三張小圖顯示了球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B #3 之前來(lái)自細(xì)胞工廠(chǎng)種子培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。這是典型的 Vero 細(xì)胞種子培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況。通常 90%以上的 Vero細(xì)胞會(huì)在接種 4 小時(shí)之內(nèi)貼到微載體上并在 24 小時(shí)內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。從圖 3 和圖 4 中各次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)之后 Vero 細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況，可以看到球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)之后細(xì)胞保持有良好的和種子細(xì)胞培養(yǎng)相似的生長(zhǎng)形態(tài)。

圖 3.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B #1和B2B #2后 Vero細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況

圖4.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #3前后 Vero細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況

 

    我們通過(guò)兩種方式嘗試把球轉(zhuǎn)球放大工藝的放大倍率提升到十倍。第一種是用 6 g/L 的微載體密度培養(yǎng) Vero 細(xì)胞至 4x10⁶/毫升左右的細(xì)胞密度。球轉(zhuǎn)球以后以十倍的放大倍數(shù)（培養(yǎng)體積放大，微載體表面積放大，或者兩者兼具）開(kāi)始新一輪的培養(yǎng)。第二種是如上以 3g/L 的微載體密度培養(yǎng)，待細(xì)胞密度接近 3x10⁶

時(shí)，進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)，并采用培養(yǎng)體積和微載體表面積均為十倍的放大倍率。為彌補(bǔ)起始細(xì)胞密度過(guò)低可能會(huì)帶來(lái)的生長(zhǎng)緩慢，我們嘗試在球轉(zhuǎn)球之后用較少的培養(yǎng)體積培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)到一定程度時(shí)，再添補(bǔ)新的培養(yǎng)基到需要的體積。觀(guān)察球轉(zhuǎn)球前后的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

 

    B2B  #4 采用第一種方式進(jìn)行高倍率放大，即用 6g/L 的微載體密度培養(yǎng) Vero細(xì)胞至細(xì)胞密度 4.3x10⁶/毫升,培養(yǎng)體積為 2 升。用胰酶把 Vero 細(xì)胞從微載體上消化下來(lái)。取十分之一的細(xì)胞/微載體懸浮液接種到新的 2 升的培養(yǎng)體積中，微載體濃度為 6g/L,這樣培養(yǎng)體積及微載體表面積的放大倍數(shù)均是十倍。作為平行比較試驗(yàn)，取十分之一的細(xì)胞/微載體懸浮液接種到另一個(gè) 2 升的培養(yǎng)體積中，微載體濃度 3 g/L,如此培養(yǎng)體積放大十倍，微載體表面積放大五倍。兩個(gè)培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

圖5.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #4前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

 

    圖 5顯示的是球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B  #4前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。有意思的是球轉(zhuǎn)球以后的兩個(gè)平行培養(yǎng)中細(xì)胞增長(zhǎng)速度基本相似，雖然其微載體密度相差了一倍。它們比種子培養(yǎng)多用了 1-2 天達(dá)到相似的細(xì)胞密度。這應(yīng)該是球轉(zhuǎn)球之后培養(yǎng)的起始細(xì)胞密度相對(duì)較低所致，但細(xì)胞倍增速度并不低。球轉(zhuǎn)球之后兩個(gè)培養(yǎng)前四天的細(xì)胞倍增速度均是 0.57 d-1，而種子培養(yǎng)前四天的細(xì)胞倍增速度是 0.54 d-1。

 

    圖 6 顯示的是球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B  #4 前后 Vero 細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況�？梢钥吹角蜣D(zhuǎn)球之后的培養(yǎng)雖然起始細(xì)胞數(shù)較少，但細(xì)胞貼壁和存活情況仍然不錯(cuò)。在其后的幾天中細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)也很穩(wěn)定和良好。雖然在最初幾天看似細(xì)胞在微載體上分布不均勻，但細(xì)胞增殖正常并在其后幾天迅速布滿(mǎn)所有的微載體。

圖6.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #4前后 Vero細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況

 

    B2B  #5 采用第二種方式進(jìn)行高倍率放大。用 3g/L 的微載體密度培養(yǎng) Vero 細(xì)胞至細(xì)胞密度 3.07x10⁶/毫升,培養(yǎng)體積為 3 升。用胰酶把 Vero 細(xì)胞從微載體上消化下來(lái)。取十分之一的細(xì)胞/微載體懸浮液接種到新的 1.5 升的培養(yǎng)體積中，微載體濃度為 6g/L。待細(xì)胞密度達(dá)到 5x10⁶/毫升以上時(shí)，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基至培養(yǎng)體積 3升。這樣培養(yǎng)體積及微載體表面積的放大倍數(shù)均是十倍，最終微載體濃度為3g/L。而在培養(yǎng)初期，細(xì)胞密度和微載體密度均得到提高，從而提高了微載體和細(xì)胞的接觸機(jī)率，理論上有利于細(xì)胞貼附到微載體上并能更好地生長(zhǎng)。作為平行比較試驗(yàn)，取十分之一的細(xì)胞/微載體懸浮液接種到另一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)袋中，培養(yǎng)體積 3升，微載體濃度 3g/L。兩個(gè)培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行，觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。

圖 7.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B #5前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

 

    圖 7 顯示的是上述球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B  #5 前后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。由于其中一個(gè)在培養(yǎng)過(guò)程中有培養(yǎng)體積的變化，這里的縱坐標(biāo)采用細(xì)胞總數(shù)。球轉(zhuǎn)球前后細(xì)胞生長(zhǎng)速度基本一致。球轉(zhuǎn)球以后細(xì)胞仍然保持旺盛的生長(zhǎng)活力。同樣有意思的是，球轉(zhuǎn)球后采用較小的培養(yǎng)體積培養(yǎng)，從而使單位體積內(nèi)細(xì)胞密度和微載體密度提高，細(xì)胞和微載體接觸機(jī)率提高，這樣的方法并沒(méi)有顯著地提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。這表明細(xì)胞在稍低的接種密度下也能很好的生長(zhǎng)起來(lái)，并不需要用降低起始培養(yǎng)體積的方法來(lái)提高接種密度。

圖8.球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)B2B #5前后 Vero細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況

 

    圖 8 顯示的是上述球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B  #5 前后 Vero 細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)情況。因球轉(zhuǎn)球之后培養(yǎng)中細(xì)胞起始密度較低，培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)了兩天。也因此，除了相應(yīng)于種子培養(yǎng)的在第一、三、六天的細(xì)胞形態(tài)外，我們這里也列出了球轉(zhuǎn)球后培養(yǎng)了九天后細(xì)胞在微載體上的形態(tài)照片。球轉(zhuǎn)球后細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)情況良好。我們也看到分別用 1.5  L 和 3  L 的起始密度培養(yǎng)細(xì)胞最初的貼附情況，貼附數(shù)量，以及后面的細(xì)胞生長(zhǎng)情況基本沒(méi)有差異。這也提示了提高單位體積內(nèi)細(xì)胞密度和微載體密度，從而提高細(xì)胞和微載體接觸機(jī)率的方法并沒(méi)有帶來(lái)太大的好處。

 

討論

 

    在這一部分的工作中，我們做了 Vero 細(xì)胞從微載體上的球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)，細(xì)胞培養(yǎng)在 WAVETM 反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行，球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)在瓶子內(nèi)或 WAVETM 培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)相當(dāng)成功，Vero 細(xì)胞的微載體培養(yǎng)在 WAVETM 反應(yīng)器內(nèi)放大是可行的。

 

    我們分別嘗試了在瓶子中（B2B  #1）和在 WAVETM 培養(yǎng)袋中（B2B  #2 和 B2B #3)進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)。在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模情況下，在瓶子中進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)相比在細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行有一定的優(yōu)勢(shì)。前者操作起來(lái)比較容易。在一個(gè)透明的瓶子中，沉降后的微載體更容易被清晰地看到，所以能更多地去除上清。這樣微載體能得到更有效的清洗。另外瓶子也可以用水浴來(lái)保持恒溫，如果不太大的話(huà)可以較劇烈地?fù)u動(dòng)。這樣細(xì)胞能更有效地脫離微載體。然而，如果考慮到大規(guī)模的培養(yǎng)，球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)需要在 WAVETM 培養(yǎng)袋內(nèi)進(jìn)行，因?yàn)檫@樣就有一個(gè)全封閉的系統(tǒng)來(lái)更好地操作較大的體積。從WAVETM 培養(yǎng)袋中進(jìn)行球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)（B2B  #2和B2B  #3) 得到的結(jié)果來(lái)看，這種方法效果也很不錯(cuò)，只是需要較多的 PBS來(lái)洗滌，胰酶的用量也稍多。

 

    胰酶消化較長(zhǎng)時(shí)間能夠更好地使細(xì)胞和微載體完全分離。但消化太長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)降低細(xì)胞活力并影響細(xì)胞重新貼壁的效果。因此胰酶消化的時(shí)間最好能控制在40 分鐘之內(nèi)。消化過(guò)程中，除消化時(shí)間外，酶用量、反應(yīng)溫度、微載體和酶之間充分的混合是保證不同微載體上細(xì)胞同步消化的重要因素，從而有效避免酶的局部過(guò)量和潛在的細(xì)胞損傷。

 

    相比攪拌罐而言，WAVE 反應(yīng)器在同一個(gè)培養(yǎng)袋中可以有更寬的培養(yǎng)范圍（10-100%工作體積），對(duì)于種子擴(kuò)增和細(xì)胞消化的不同反應(yīng)體積，都可以提供均勻有效的混合，從而實(shí)現(xiàn)微載體的原位消化，而無(wú)需特定的消化反應(yīng)器。避免了消化前后微載體的轉(zhuǎn)移，操作簡(jiǎn)單，均勻有效的混合有利于精密控制消化反應(yīng)的條件，最大程度保證細(xì)胞的完整性和回收，成為微載體球轉(zhuǎn)球成功放大的關(guān)鍵。

 

    球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn) B2B  #4 和#5 的結(jié)果提示，球轉(zhuǎn)球進(jìn)行高倍率放大也完全可行，放大倍率可以達(dá)到十倍，前提應(yīng)該是讓種子培養(yǎng)達(dá)到足夠的細(xì)胞密度以保證能有足夠多的細(xì)胞進(jìn)入下一步培養(yǎng)。足夠的細(xì)胞接種密度，以及細(xì)胞數(shù)和微載體表面積的比例兩者共同保證了細(xì)胞的有效貼壁并快速進(jìn)入生長(zhǎng)期。而我們的實(shí)驗(yàn)表明，球轉(zhuǎn)球后微載體表面積或者是培養(yǎng)體積的在小范圍內(nèi)的變化均不會(huì)對(duì)細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)產(chǎn)生太大的影響。

 

    我們?cè)谶@里所描述的幾次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)均是把一部分舊的微載體同細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移來(lái)完成的。從各次球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)前后細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)的形態(tài)來(lái)看，細(xì)胞能在微載體上均勻地分布。因此，舊的微載體同細(xì)胞一起轉(zhuǎn)移并不影響細(xì)胞貼壁到新的微載體上。如果不和舊的微載體一起轉(zhuǎn)移的話(huà)，就需要把細(xì)胞和微載體分離。這就意

味著需要額外的步驟和較長(zhǎng)的工藝時(shí)間。這些額外的步驟還需要更多復(fù)雜的設(shè)備因而也增大了污染的風(fēng)險(xiǎn)。由于細(xì)胞沒(méi)有在微載體上不均勻的分布或更集中于舊微載體的情況，我們認(rèn)為沒(méi)有必要把細(xì)胞和舊的微載體分開(kāi)。

 

結(jié)論

 

    通過(guò)在瓶子里或直接在細(xì)胞培養(yǎng)袋中進(jìn)行的細(xì)胞和微載體分離的方法，WAVETM 反應(yīng)器中的球轉(zhuǎn)球?qū)嶒?yàn)?zāi)軌虺晒Φ剡M(jìn)行。且放大倍率可以很容易地達(dá)到十倍。轉(zhuǎn)移之后 Vero 細(xì)胞能保持和種子細(xì)胞相似的生長(zhǎng)特征。生長(zhǎng)在微載體上的Vero 細(xì)胞用 37℃預(yù)熱的 PBS-EDTA 洗滌，用 37℃預(yù)熱的胰酶進(jìn)行處理，胰酶處理的時(shí)間不超過(guò)40分鐘。轉(zhuǎn)移過(guò)程中沒(méi)有必要把細(xì)胞和舊的微載體分開(kāi)。

 

    WAVE 微載體球轉(zhuǎn)球技術(shù)為微載體細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模放大提供了可靠支持，該技術(shù)可以在同一個(gè)培養(yǎng)袋中實(shí)現(xiàn)原位消化，然后直接轉(zhuǎn)移到更大規(guī)模的 WAVE 反應(yīng)器中重新貼壁擴(kuò)增而無(wú)須使用單獨(dú)的消化反應(yīng)器，消化條件容易控制，設(shè)備投資成本低；無(wú)菌焊接機(jī)和封口機(jī)配合細(xì)胞培養(yǎng)袋可以方便的實(shí)現(xiàn)無(wú)菌管道化封閉生產(chǎn)，不僅操作簡(jiǎn)單避免污染，同時(shí)防止操作人員對(duì)病毒的暴露，實(shí)現(xiàn)更加安全的生產(chǎn)操作。因此，WAVE 生物反應(yīng)器進(jìn)行規(guī)�；�微載體細(xì)胞培養(yǎng)可以取代繁冗的轉(zhuǎn)瓶和多個(gè)小規(guī)模反應(yīng)器的培養(yǎng)工藝，成為疫苗規(guī)�；�大生產(chǎn)的發(fā)展趨勢(shì)。

 

參考文章

[1]. History and Characterization of the Vero Cell Line -- A Report prepared by CDR Rebecca  Sheets, Ph.D., USPHS CBER/OVRR/DVRPA/VVB for the Vaccines and Related Biological  Products Advisory Committee Meeting to be held on May 12, 2000 OPEN SESSION www.fda.gov pdf

[2]. Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain  induces cross-protective immune responses. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Bruohl  P, Gerencer M, Crowe BA, Savidis-Dacho H, Livey I, Reiter M and others. 2007, Vaccine 25(32):6028-6036.

[3]. Flu Vaccine Race Against The Clock. Thayer AM. 2009, Chemical & Engineering News, September 28, 2009, 87(39), p27-33

[4]. A novel mammalian cell (Vero) derived influenza virus vaccine: Development, characterization and industrial scale production. Kistner O, Barrett PN, Mundt W, Reiter M,  Schober-Bendixen S, Eder G, Dorner F. 1999. Wiener Klinische Wochenschrift 111(5):207-214.

[5]. High immunogenic enterovirus 71 strain and its production using serum-free microcarrier Vero cell culture. Liu CC, Lian WC, Butler M, Wu SC. 2007. Vaccine 25(1):19-24.