苗景赟    王奕軍   (通用電氣醫(yī)療集團 GE Life Sciences)

 

 

 

    在人類與各種疫病的長期斗爭過程中，沒有任何其它醫(yī)療措施能像疫苗一樣對人類的健康產(chǎn)生如此重大影響，也沒有任何其它的治療藥品能像疫苗一樣以其低廉代價把某種疾病從地球上消滅^[1] 。

 

    近年國內(nèi)外生物技術(shù)不斷發(fā)展，出現(xiàn)多個年銷售額超過10億美元的重磅炸彈疫苗藥物，如流感疫苗、肝炎疫苗、宮頸癌疫苗和肺炎多糖疫苗等。2008年到2010年全球疫苗年復合增長率超過14%，2009年全球疫苗總產(chǎn)值超過220億美元，全球疫苗總產(chǎn)值在2012年預計將突破400億美元^[2] 。國內(nèi)疫苗市場在2009年也超過13億美元，且以20%以上的速度復合增長，2009年SFDA疫苗批簽發(fā)超過10億劑量 ，病毒類疫苗約占60% ^[3] 。

 

    國內(nèi)疫苗產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，擁有近40家疫苗企業(yè)可以生產(chǎn)約50種疫苗藥物，目前已建成年產(chǎn)超過1.6億劑量的甲流疫苗生產(chǎn)線^[4] 。但與此同時，國內(nèi)疫苗企業(yè)也面臨著諸多嚴峻挑戰(zhàn)：

 

     (1) 生產(chǎn)規(guī)模小，產(chǎn)能不足

    我國人口眾多，人民群眾對各種疫苗的需求增長迅速。而國內(nèi)疫苗生產(chǎn)規(guī)模普遍較小，產(chǎn)能較低，難以滿足疫苗規(guī)�；�生產(chǎn)的需求。以狂犬滅活疫苗為例，國內(nèi)部分廠家已經(jīng)采用多個30L或14L小規(guī)模攪拌生物反應器結(jié)合微載體技術(shù)進行細胞培養(yǎng)平行放大代替轉(zhuǎn)瓶工藝，但是多個反應器操作仍較繁瑣，難以保證不同亞批產(chǎn)品的質(zhì)量均一性，同時增加了工藝驗證的難度。

 

    新型WAVE生物反應器結(jié)合微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)和球轉(zhuǎn)球放大工藝為貼壁細胞規(guī)�；�培養(yǎng)和放大提供了可能性，使用較大規(guī)模的生物反應器可以顯著降低工作強度，減少生產(chǎn)批次和過程控制，提高產(chǎn)能和快速響應能力。目前WAVE已經(jīng)成功的用于細胞流感疫苗、脊髓灰質(zhì)炎、昆蟲細胞VLP 新型疫苗 (Novavax, Inc) 等；2005年，以新型天花疫苗和治療性HIV 疫苗著稱的丹麥Bavarian Nordic 公司將WAVE 1000 成功的用于新型MVA疫苗的GMP生產(chǎn)^[5] 。

 

    中空纖維膜過濾技術(shù)是一種快速高效的現(xiàn)代膜分離技術(shù)，壽命長成本低、可以直接線性放大，滿足疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)純化需要。

 

    (2) 疫苗質(zhì)量亟需提高

    疫苗廣泛使用于廣大健康人群，因此對疫苗產(chǎn)品的安全性要求極高，國家藥監(jiān)部門也不斷提高多種疫苗的質(zhì)量控制標準，提高疫苗質(zhì)量已經(jīng)成為生產(chǎn)過程控制的關(guān)鍵。然而，國內(nèi)部分疫苗仍采用較傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，如轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、絹布過濾、透析等，迫切需要引入新的現(xiàn)代生物技術(shù)對現(xiàn)有生產(chǎn)工藝進行改進。中空纖維膜分離技術(shù)提供更均一的膜孔徑和低剪切力，通過對過程參數(shù)的優(yōu)化和控制，不僅有利于保護病毒大分子的活性，還可以更好的去除各種雜質(zhì)，提高產(chǎn)品質(zhì)量，顯著改善生產(chǎn)效率，成功的代替絹布過濾和透析等操作。

 

    (3) 對新技術(shù)需求迫切

    新技術(shù)不斷涌現(xiàn)為疫苗的發(fā)展提供新的方向和發(fā)展趨勢，如昆蟲細胞/桿狀病毒新型基因工程重組VLP疫苗、病毒載體疫苗、DNA疫苗、聯(lián)合疫苗、口服疫苗、治療性疫苗和新型佐劑等逐漸成為研究熱點。

 

    GE Life Sciences作為生物制藥行業(yè)的領(lǐng)先者，和國內(nèi)外知名制藥公司/研究院所緊密合作，不斷開發(fā)新的產(chǎn)品和應用，提供從上游大規(guī)模細胞培養(yǎng)、中空纖維切向流過濾、層析精細純化以及 Biacore分析質(zhì)控在內(nèi)的病毒類疫苗整體解決方案^[6,7] 。

 

    2.1中空纖維膜過濾原理簡介

    中空纖維膜過濾技術(shù)屬于切向流過濾技術(shù)（Tangential Flow Filtration, TFF）的范疇，又稱錯流過濾（Cross-Flow Filtration，CFF），其操作原理如圖1：料液以一定的流速在膜的上表面循環(huán)，小于膜孔徑的物質(zhì)可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質(zhì)會被膜截留，從而實現(xiàn)目標物質(zhì)的濃縮以及不同物質(zhì)的分級分離^[8] 。

    和傳統(tǒng)的平板膜包相比，中空纖維膜具有纖維管狀的開放式流道結(jié)構(gòu)(圖 2)，無篩網(wǎng)的管狀流道結(jié)構(gòu)避免了料液的無規(guī)則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，有利于保護大分子病毒的完整性，防止病毒顆粒聚集的同時有助于雜蛋白的透過和去除。

 

    中空纖維膜按孔徑分為超濾膜和微濾膜，孔徑齊全：超濾中空纖維膜(如750k)常用于蛋白質(zhì)或病毒顆粒溫和快速的濃縮；而微濾中空纖維膜( 如 0.45µm, 0.65um )可以直接用于培養(yǎng)液中細胞和細胞碎片的去除，實現(xiàn)層析柱前料液的澄清，省去離心過濾等預處理步驟。中空纖維膜具有良好的物理化學耐受性，超濾中空纖維膜入口耐壓大于4bar，可以在50度下耐受1M NaOH/300ppm NaClO進行徹底清洗，大多數(shù)中空纖維膜還可以高壓滅菌，壽命長，成本低^[9] 。

 

    中空纖維膜開放式流道解決了病毒顆粒濃縮時易堵膜和對剪切力敏感易聚集兩大技術(shù)難題，提供了較溫和的超濾方法以有效保護病毒顆粒的完整性，因此廣泛應用于疫苗等生物制藥和生命科學研究領(lǐng)域^[10] 。

 

    中空纖維750k超濾膜采用先進的膜加工制造工藝，具有均一的孔徑分布，有效截留病毒的同時避免病毒在膜上的沉積，速度快收率高，同時較大的孔徑使得DNA和雜蛋白等雜質(zhì)透過而加以去除，降低濃縮后的料液黏度，提高產(chǎn)品質(zhì)量^[16] 。

 

    美國默克公司將中空纖維過濾膜用于多種疫苗的生產(chǎn)，如使用300k中空纖維膜進行重組酵母乙肝疫苗的濃縮和洗濾，使用0.65µm 中空纖維膜澄清酵母裂解液生產(chǎn)HPV疫苗等[11]。 Bernd Kalbfuss 等人將750k中空纖維膜用于MDCK細胞流感病毒培養(yǎng)液的濃縮，發(fā)現(xiàn)中空纖維750k超濾膜可以有效去除宿主DNA等雜質(zhì)^[12,13] 。C. Peixoto 等使用中空纖維750k濃縮輪狀病毒的昆蟲細胞培養(yǎng)液，優(yōu)化后的濃縮收率達86%，濃縮的同時去除97%的DNA。最終得到高純度的輪狀病毒VLP類病毒顆粒, 工藝總收率37% ^[14] 。

 

    中空纖維化學穩(wěn)定性極佳，壽命長，單位膜面積成本低，也廣泛用于口蹄疫、狂犬等獸用病毒類疫苗的濃縮，改善產(chǎn)品質(zhì)量。呂洪亮等在2009年成功的使用750k中空纖維進行獸用狂犬疫苗的濃縮，研究結(jié)果表明：相比100k和500k的超濾膜，750k中空纖維膜可以充分截留狂犬病毒，實現(xiàn)高抗原收率，同時有效去除牛血清白蛋白，提高疫苗的安全性、有效性和穩(wěn)定性。最終成功建立了Cytodex 1微載體細胞培養(yǎng)、中空纖維750k濃縮、Sepharose 6FF層析純化的高質(zhì)量獸用狂犬疫苗生產(chǎn)新工藝 ^[15] 。目前采用此工藝的純化獸用滅活狂犬疫苗已經(jīng)獲得新獸藥證書正式投產(chǎn)。

 

    3.中空纖維濃縮病毒培養(yǎng)液實例

    相對于其他雜蛋白和DNA等雜質(zhì)，病毒顆粒具有較大的分子量，因而可以使用超濾膜過濾和分子篩等技術(shù)按照分子量大小進行分離分級，建立通用的病毒純化工藝。病毒類疫苗通常使用微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)進行病毒培養(yǎng)，一定滴度的病毒培養(yǎng)收獲液通過 1-2um玻璃纖維GF澄清過濾去除細胞碎片和部分 DNA，超濾膜濃縮 10-80倍，經(jīng)滅活水解之后使用 Sepharose 4FF或 6FF分子篩層析按照分子量大小進行精細純化^[16] 。

圖 3 通用的病毒疫苗生產(chǎn)工藝

    病毒超濾濃縮通常使用 100-300k膜包，膜包篩網(wǎng)剪切力易造成病毒顆粒聚集和表面蛋白的脫落，從而影響病毒活性收率，因此對操作要求極高；此外，膜包篩網(wǎng)剪切力還容易加速雜蛋白的聚集（如牛血清白蛋白，卵清蛋白等），而100-300k較小的膜包孔徑不利于濃縮過程中雜蛋白透過，因此濃縮液雜蛋白含量在濃縮過程中不斷增加，蛋白凝膠層顯著影響濃縮處理速度，較高的黏度也不利于后期4FF分離純化和填料壽命。

 

    狂犬病毒屬于彈狀病毒科，病毒包膜的次突上的糖蛋白G是唯一暴露于病毒外部的病毒蛋白，是誘發(fā)細胞與體液免疫的主要抗原物質(zhì)^[17] 。超濾濃縮過程中需要盡量溫和以避免G蛋白的脫落，保護病毒的免疫原性，同時盡可能去除雜蛋白和 DNA片斷。

 

    3.1.1 實驗條件

樣品：澄清病毒收獲液 (CTN株，Vero細胞 Cytodex 1微載體連續(xù) 培養(yǎng)，Lot20090401)

實驗設(shè)備：Quixstand 中空纖維衛(wèi)生級超濾系統(tǒng)（可整體高壓滅菌）

 AKTA Purifier10 層析儀

中空纖維超濾柱：UFP-750-E-4x2MA_0.085m2  (750kDa MWCO，GE)

Cassette 300k膜包0.1m2（某進口品牌）

檢測方法：LD50病毒滴度(藥典2010)，Elisa，Sepharose 4FF 16/40分析柱，目測外觀

 

    3.1.2 實驗結(jié)果

    我們分別使用中空纖維 750k超濾柱(GE)和 300k超濾膜包(某進口品牌) 進行狂犬病毒收獲液的濃縮，考察處理速度、病毒顆粒收率和濃縮液澄清度等指標。除病毒滴度外，濃縮液使用Sephorase 4FF 16/40分子篩分析柱進行分析，快速檢測比較雜質(zhì)殘留。

 

表1狂犬病毒培養(yǎng)液超濾濃縮實驗條件

    使用 750k中空纖維和 300k膜包濃縮過程的通量-透過體積曲線見下圖(Flux-Permeate Vol)。使用中空纖維 750k超濾柱進行狂犬病毒培養(yǎng)液濃縮，濃縮 20倍然后濾洗 3倍，整個過程需要 1小時 16分，平均處理通量 61 L/m2/hr (LMH)。使用膜包300k進行濃縮，濃縮20倍然后濾洗3倍，整個過程歷時 1小時 20分，平均處理通量 49 LMH。

 

    使用 Sepharose 4FF分子篩分析柱對濃縮液進行分析，快速檢定濃縮液中雜質(zhì)的殘留，并比較病毒和雜質(zhì)的分離情況，結(jié)果見圖 5所示。

 

    使用兩種不同的超濾膜進行濃縮，所得濃縮液中病毒顆粒的積分面積相當，因此 750k中空纖維和 300k膜包都可以很好的截留病毒顆粒；然而，中空纖維 750k的濃縮液中小分子面積較小，表明 750k中空纖維可以使更多的小分子雜蛋白/核酸等雜質(zhì)透過加以去除，在濃縮的同時提高產(chǎn)品的純度，這一點也直觀的表現(xiàn)在 750k所得病毒濃縮液外觀更加澄清、黏度較低。

    中空纖維 750k具有更大的平均膜孔徑，濾膜阻力較小，有利于雜蛋白的透過，濃縮過程中可以緩解高濃度雜蛋白引起的膜表面凝膠層，因此具有更快的處理速度，其平均透過通量可達61 LMH，比 300k膜包快 24%。這意味著選用同樣膜面積，中空纖維膜的超濾濃縮時間將顯著縮短，有利于保護病毒顆粒的穩(wěn)定性，提高生產(chǎn)效率。

 

    從上下游工藝綜合考慮，通過對層析前雜質(zhì)的有效去除，所得濃縮液雜蛋白含量少，黏度低，有利于降低后期4FF分子篩層析純化的負擔，改善分子篩的分辨率，并且降低層析柱堵塞風險，延長填料使用壽命，整個工藝具有更好的經(jīng)濟性。

 

    3.2 流感病毒尿囊液的濃縮

    流感病毒屬于正粘病毒科，分為甲乙丙三型，病毒包膜含有血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)，血凝抑制抗體為中和抗體，誘發(fā)機體免疫保護作用^[17] 。

 

    2007年世界首個細胞流感疫苗 Optaflu(諾華)經(jīng)歐盟批準已經(jīng)成功上市^[18] ，但由于細胞規(guī)�；�培養(yǎng)技術(shù)和毒株適應等諸多問題，目前國內(nèi)流感疫苗的生產(chǎn)仍使用傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)方式。雞胚中含有大量的卵清蛋白等雜質(zhì)，殘留的卵清蛋白對人體會產(chǎn)生副反應。近年來SFDA不斷提高疫苗制品中卵清蛋白的殘留標準以保證疫苗的安全：卵清蛋白小于500ng/ml, 總蛋白小于HA 含量的4.5倍等 ^[19] 。

 

    作為層析分離前的重要的預處理步驟，超濾濃縮需要盡量溫和以保護病毒的免疫原性，同時防止卵清蛋白的聚集以盡可能的將其透過去除，確保整個工藝的雜質(zhì)去除能力。

 

    3.2.1 實驗條件

病毒培養(yǎng)液：甲I型流感病毒尿囊液(Lot20080512)，0.8um澄清

實驗設(shè)備： Quixstand 中空纖維衛(wèi)生級超濾系統(tǒng)

中空纖維超濾柱：UFP-750-C-4MA_0.065m2 (750kDa MWCO)

                UFP-500-E-4MA_0.042m2  (750kDa MWCO)

                Cassette 300k膜包0.1m2 （某進口品牌）

                Cassette 500k膜包0.1m2（某進口品牌）

檢測方法： HA血凝滴度，Lowry總蛋白，目測外觀

 

    3.2.2 實驗結(jié)果

    我們分別使用中空纖維 750k和500k超濾柱(GE)、300k和500k超濾膜包(分別來自于兩家進口品牌) 進行流感病毒尿囊液的濃縮洗濾，考察處理速度、病毒 HA收率、總蛋白和濃縮液澄清度等指標。

使用中空纖維和膜包進行濃縮，均采用先濃縮后洗濾的策略，先濃縮20倍即開始濾洗5倍，然后繼續(xù)濃縮至50x左右。這樣可以避免高濃度卵清蛋白聚集，提高卵清蛋白的透過去除效率，提高產(chǎn)品質(zhì)量。

 

    3.2.3 分析討論

    我們比較了上述不同孔徑的中空纖維膜和超濾膜包對流感病毒尿囊液的濃縮性能：

 

使用中空纖維膜和超濾膜包進行流感病毒尿囊液濃縮，除 500k膜包在透過端有HA血凝滴度檢出外，其余三種膜均無漏過，HA收率令人滿意。中空纖維750k 濾膜平均處理速度為 35LMH，比 300k膜包快60%以上。

 

    中空纖維 750k和中空纖維 500k相比，750k 濾膜使用切向流速相對較低，可以在保證病毒穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，適當提高切向流速，進一步提高處理速度。

 

    所得尿囊濃縮液中，單位血凝價的總蛋白(TP/HA)可以用于快速直觀的表征濃縮液中的雜蛋白殘留量。單位血凝價的總蛋白含量越低，說明濃縮過程的雜蛋白透過去除更徹底，所得濃縮液病毒相對純度越高。由上表的數(shù)據(jù)可見，500k和 750k中空纖維進行濃縮，雜蛋白的含量均低于 300k 膜包，其中 500k中空纖維膜單位血凝價的總蛋白比 300k膜包低7%，750k中空纖維單位血凝價的總蛋白比 300k膜包低 1倍以上，中間產(chǎn)物質(zhì)量顯著得到改善。

 

 

    將不同孔徑中空纖維濾膜所得尿囊濃縮液外觀進行比較 (如圖6)：中空纖維750k顏色淺白，黏度低，卵清蛋白去除較為徹底；而500k中空纖維膜仍為淺黃色，去除效果稍差。相比傳統(tǒng) 300k膜包而言，中空纖維顯著改進了濃縮液中間產(chǎn)物質(zhì)量，有利于減輕后期4FF層析純化的負荷，保證整體工藝的可靠性。

    在此基礎(chǔ)上，我們下一步將使用中空纖維750k濾膜對不同型流感尿囊液的濾洗時機、濾洗緩沖液組成、切向流速和壓力等參數(shù)進行深入優(yōu)化，避免卵清蛋白聚集，進一步提高卵白去除效率。

 

    本文的研究結(jié)果表明：

    中空纖維 750k超濾膜成功的用于狂犬病毒收獲液的濃縮和洗濾，膜處理量大于 70L/m2，平均處理速度達 61 LMH，處理時間僅 1.2小時，病毒收率近 100%，濃縮后產(chǎn)品外觀澄清度好，病毒純度 22% (面積歸一化法)，比膜包提高 7%。中空纖維750k超濾膜成功的用于流感病毒尿囊液的濃縮和洗濾，膜處理量大于 90L/m2，平均處理速度達 35 LMH，處理時間小于 4小時，HA血凝滴度收率 95% 以上，濃縮后產(chǎn)品外觀顏色淺白，澄清度好，單位血凝價的總蛋白(TP/HA)比300k膜包降低一倍以上。

 

    中空纖維膜具有開放式流道，解決了病毒顆粒濃縮時易堵膜和對剪切力敏感易聚集兩大技術(shù)難題，提供了較溫和的超濾方法，因此非常適合病毒類疫苗的工藝開發(fā)和規(guī)模生產(chǎn)。

 

    不同來源的濾膜由于加工制造工藝和質(zhì)控標準不同，因此濾膜標稱孔徑和實際孔徑大小分布存在一定的差異，需要在工藝優(yōu)化過程中對不同來源不同孔徑的濾膜進行比較和優(yōu)化。膜孔徑直接決定了濃縮的效率和產(chǎn)品質(zhì)量。一方面需要選擇膜孔徑能夠使目標分子有效截留以保證收率，另一方面要充分考慮雜蛋白的去除效果和處理速度。因此最佳的原則為：選擇可以截留目標分子的孔徑最大的膜，并且盡量選擇孔徑分布均一的濾膜。如相對較大孔徑的中空纖維 750k膜具有均一的孔徑分布，可以充分截留病毒顆粒，同時有利于DNA片斷和 BSA等雜蛋白透過，實現(xiàn)病毒顆粒的溫和濃縮和有效純化。濃縮過程中雜質(zhì)的有效去除，一定程度上避免了雜蛋白的累積，有利于防止膜表面蛋白凝膠層的形成，從而具有更快的處理速度，縮短工藝時間。

 

    本文成功的將中空纖維 750k超濾膜用于狂犬疫苗和雞胚流感疫苗的溫和濃縮和純化。結(jié)果表明中空纖維 750k溫和的超濾濃縮操作簡單，有利于保持病毒顆粒的活性以實現(xiàn)高病毒收率，同時更好的去除雜蛋白等雜質(zhì)，濃縮液黏度低澄清度好，有利于提高后期層析分離度，延長 4FF填料的壽命。

 

    日益突出的疫苗安全性問題要求疫苗生產(chǎn)企業(yè)對生產(chǎn)工藝過程和工藝參數(shù)嚴格控制，需要將上下游工藝綜合考慮，在維持上游培養(yǎng)工藝穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，盡可能提高每一步單元操作的雜質(zhì)去除效率，保證最終的產(chǎn)品質(zhì)量。

    使用中空纖維750k超濾膜，通過對層析前部分雜質(zhì)的有效去除，所得濃縮液雜蛋白含量少，黏度低，有利于降低后期 4FF分子篩層析純化的負擔，改善分子篩的分辨率，并且降低層析柱堵塞風險，延長填料使用壽命，整個工藝具有更好的經(jīng)濟性。

 

    中空纖維膜過濾技術(shù)還具有溫和低剪切力、不易堵塞、操作靈活、壽命長成本低、易于放大等優(yōu)點，因此廣泛應用于疫苗、單抗等生物制藥和生命科學研究領(lǐng)域。本文的實驗結(jié)果表明，中空纖維膜過濾技術(shù)可以成功的用于狂犬疫苗和流感疫苗的濃縮和生產(chǎn)，有利于改進疫苗產(chǎn)品質(zhì)量、提高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

 

圖7 中空纖維過濾系統(tǒng)用于大規(guī)模疫苗生產(chǎn)

 

    基于中空纖維膜過濾技術(shù)的上述優(yōu)點，國外已成功建立了用于處理大規(guī)模病毒培養(yǎng)液的中空纖維系統(tǒng)（圖 7），如口蹄疫病毒疫苗、豬瘟病毒疫苗、細菌類毒素疫苗等。國內(nèi)多家知名人用和獸用疫苗企業(yè)也開始使用和建立大規(guī)模中空纖維系統(tǒng)進行疫苗的生產(chǎn)，國內(nèi)最大規(guī)模的中空纖維系統(tǒng)已經(jīng)達到 400平米，運行良好。

目前，中空纖維膜過濾技術(shù)已越來越廣泛的用于疫苗、抗體和其他生物藥物的生產(chǎn)，有助于推動整個生物制藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進步和發(fā)展！

 

1, 沈心亮；中國疫苗應用現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢；新一代生物技術(shù)藥物國際論壇，2002 年 10 月15 日，北京

2, Kalorama Information: http://www.kaloramainformation.com

3, Report: The study reviews, analyzes and projects the global market for Biopharmaceuticals for the period 2006‐2015, Industry Expert, 2010 April

4, 機遇與責任并重甲流疫苗市場商機無限，中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導報，2009/7/13

5, WAVE細胞培養(yǎng)手冊，GE Life Sciences, 2010

6, Estmer Nilsson C. et al. A novel assay for influenza virus quantification using surface plasmon resonance. Vaccine 28, 759–766 (2010)

7, Andersson, E. Optimization of method for analysis of host cell proteins from Madine-Darby Canine Kidney and Chinese Hamster Ovary cells- using Biacore, MSc thesis, Uppsala University 2009

8, 苗景赟等，中空纖維膜過濾技術(shù)在單抗生產(chǎn)中的應用，GE Healthcare，2009

9, 中空纖維操作手冊，GE Life Sciences

10, 羅亮，純化病毒疫苗的通用方法，GE Healthcare, 2004

11, James C. Cook et al, Purification of Virus-like Particles of Recombinant Human Papillomavirus Type 11 Major Capsid Protein L1 from Saccharomyces cerevisiae, Protein Expression and Purification, 17, 477~484 (1999)

12, Bernd Kalbfuss et al, Harvesting and Concentration of Human Influenza A Virus Produced in Serum-Free Mammalian Cell Culture for the Production of Vaccines，Biotechnology and Bioengineering, Vol. 97, No. 1, May 1, 2007；   

13, Bernd Kalbfuss et al, Purification of Cell Culture-Derived Human Influenza A Virus by Size-Exclusion and Anion-Exchange Chromatography, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 96, No. 5, April 1, 2007

14, C. Peixoto, et al, Downstream processing of triple layered rotavirus like particles, Journal of Biotechnology 127 (2007) 452–461

15, 呂洪亮等，獸用滅活純化狂犬疫苗生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，中國生物制品學雜志，Vol 22, No.9, 2009

16, 羅亮，疫苗生產(chǎn)純化，GE Healthcare, 2004

17, 趙鎧等，醫(yī)學生物制品學，第二版

18, http://www.ebiotrade.com/newsf/2007-6/2007617155643.htm，生物通網(wǎng)站，2007年 6月

19, 中國人民共和國藥典三部，2010版