COLD-PCR和高分辨率溶解結(jié)合使用，高效的篩查和鑒定癌癥基因低水平的未知突變

研究背景：

癌癥中體細(xì)胞分子層面的突變，常常需要在大量野生型DNA中辨識低濃度的DNA突變。但是，突變檢測方法的選擇率和靈敏度常常限制了鑒定低濃度突變的可靠性。最近開發(fā)的COLD-PCR（低變性溫度下的復(fù)合擴增，李等人。2008）解決了低含量基因突變檢測的一些局限性，在PCR擴增過程中利用關(guān)鍵變性溫度豐富含有突變的擴增子，不論突變位于序列的什么地方。COLD-PCR的一個主要屬性是富集突變體以便于在PCR后的直接測序。然而堿基測序仍然是昂貴的選擇，從而通過高通量掃描序列預(yù)檢是有吸引力的辦法。高分辨率融解（HRM）是一種可用于預(yù)篩查測序之前未知突變的技術(shù)，但不能確定具體的檢測基因突變的身份。因此，為了富集、快速篩查和鑒定低濃度的未知突變，我們把HRM突變掃描和COLD-PCR相結(jié)合，隨后進(jìn)行已知突變的直接測序鑒定。

方法：

一系列稀釋的HCC2157細(xì)胞系和SW480 (ATCC)細(xì)胞雄株基因組DNA準(zhǔn)備用于評估方法的靈敏度。
TP53基因的外顯子7和8通過常規(guī)PCR和COLD-PCR進(jìn)行擴增。COLD-PCR使用較低的變性溫度（低于擴增變性溫度~1℃）來優(yōu)先擴增在序列上含有突變的DNA。使用Cepheid SmartCycler II PCR儀。
對PCR擴增產(chǎn)物中存在的突變隨后通過HRM在LightScanner HR96 (Idaho Technologies Inc.)上進(jìn)行篩選
擴增產(chǎn)物在美國Dana - Farber研究所分子生物學(xué)的核心機構(gòu)進(jìn)行測序，驗證突變的位點和類型。
這種方法使用人類肺腺癌手術(shù)的DNA樣本進(jìn)行評價。

系列稀釋為檢測HRM靈敏度

常規(guī)PCR擴增子的HRM分析，具有一個突變檢測極限，4.0%到10.0%（外顯子7）。(圖1A)

COLD-PCR擴增子的HRM分析，具有一個突變檢測極限，0.25%到1.0%（外顯子7）。(圖1B)

這證明通過COLD-PCR-HRM方法進(jìn)行檢測,比常規(guī)PCR-HRM法靈敏度提高了10-20倍
TP53基因外顯子7比外顯子8的擴增效率低,這是由于兩者存在不同的熔化區(qū)域.(數(shù)據(jù)沒列出)

肺腫瘤的HRM分析
TP53基因第7外顯子，常規(guī)PCRP-HRM和COLD-PCR-HRM兩種方法都發(fā)現(xiàn)所有7種已知突變，（圖2）兩種方法均有野生對照組。

TP53基因第8外顯子，常規(guī)PCR-HRM可靠地檢測出6個低含量的突變，但3個得分為“未知”，這表明可能存在突變。
COLD-PCR擴增產(chǎn)物的HRM分析確認(rèn)了所有的9種低含量的突變，（圖3）包括通過常規(guī)PCRHRM分類為“未知”的三種突變。

序列分析：

這里評價的16個突變，半數(shù)無法通過常規(guī)PCR的擴增產(chǎn)物可靠地測序確定
COLD-PCR擴增產(chǎn)物的序列分析準(zhǔn)確定義外顯子7里94%的突變和100%的外顯子8突變。代表測序圖見圖4。

盡管通過COLD-PCR對突變進(jìn)行富集，一個突變（樣本TL78）不能通過測序來鑒定，可能是目前是TP53基因外顯子7的擴增產(chǎn)物中突變檢測的底限。我們推測TL78的突變在野生等位基因間的小于1%。