多個(gè)序列突變的篩查-高分辨率熔解曲線分析（HRMA）

摘要：雙鏈DNA分子轉(zhuǎn)化為兩個(gè)單鏈分子，DNA分子變性或熔解用于研究DNA結(jié)構(gòu)和組成已經(jīng)有多年。最近，新技術(shù)的進(jìn)步提高了這種技術(shù)的潛力，尤其是用于DNA序列突變的檢測(cè)。通過(guò)飽和DNA染料的發(fā)展和設(shè)備的改善，熔解的靈敏度和特異性有了很大的提高（改良的溫度精確地結(jié)合每個(gè)時(shí)間單位溫度的精確測(cè)量）。熔解分析已使用這些新設(shè)備用于高分辨熔解曲線分析（HRM或HRMA）�；�于它的易用性、靈活性、低成本、非破壞性、高靈敏度和特異性的特點(diǎn)，高分辨熔解曲線分析已成為篩選病人致病突變的首選工具。這里我們將簡(jiǎn)短地討論高分辨熔解曲線分析目前的發(fā)展，特別回顧它在其它方面的應(yīng)用，包括前序列篩查，單核苷酸多態(tài)性分型，甲基化分析，定量（拷貝數(shù)變異和鑲嵌性），替代凝膠電泳和克隆�？傊�，這些不同的應(yīng)用使高分辨率熔解曲線分析成為了一種多用途的技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，可用于任何核酸研究的實(shí)驗(yàn)室中

關(guān)鍵詞：突變篩查；甲基化；熔解曲線分析；HRM；HRMA

硬件

    有幾個(gè)供應(yīng)商生產(chǎn)高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)（HRM或HRMA）。整體而言，這些系統(tǒng)能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，但是差異很大[Herrmann et al., 2006, 2007]。目前可用的靈敏度最高的系統(tǒng)是HR-1(鹽湖城市，由他大學(xué)，愛德華科技有限公司)，熒光信號(hào)產(chǎn)生于55—95℃，溫度以0.1℃/s升降，200個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)/℃。一些實(shí)驗(yàn)，例如，多個(gè)SNP測(cè)定[Seipp et al., 2008]，關(guān)鍵取決于這個(gè)分辨率。HR-1使用玻璃毛細(xì)管每次分析一個(gè)樣品；其它玻璃毛細(xì)管系統(tǒng)可分析32個(gè)樣品。微孔板系統(tǒng)更受歡迎、使用方便，可同時(shí)分析96或384個(gè)樣品。另一個(gè)區(qū)別是系統(tǒng)是否僅用于高分辨率熔解曲線分析或是否是PCR結(jié)合高分辨溶解曲線分析的設(shè)備。Rouleau等很好地證明了定量PCR結(jié)合HRMA設(shè)備在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中可以用于定量（缺失/重復(fù)）和定性（核苷酸）的改變。
    在大多數(shù)系統(tǒng)中小的板孔之間的溫度差異影響靈敏度。Seippet al. [2007]通過(guò)增加控制溫度的低溫和高溫溫度校準(zhǔn)探針避免這個(gè)問(wèn)題。分析軟件可以利用探針的熔解位置彌補(bǔ)板孔之間的溫度差異，減小Tm標(biāo)準(zhǔn)偏差38%，顯著地提高了靈敏度。值得注意的是，高分辨熔解曲線分析軟件的使用決定最終靈敏度的重要因素[Herrmann et al.,2007]，但并不是所有的軟件包有利于溫度校準(zhǔn)探針的使用。
    LC-Green是第一種可用的飽和染料[Wittwer et al.,2003];目前，已有多種飽含染料。包LCGreens1(IdahoTechnology Inc.), Syto9s (Invitrogen, Carlsbad, CA), EvaGreens (Biotum) 和LightCyclers 480 ResoLight Dye (Roche, Indianapolis,IN)。價(jià)格差異很大；所有的飽和染料都有一些差異，它們對(duì)PCR緩沖液和反應(yīng)條件要求略有不同。
高分辨熔解曲線分析的完成非常簡(jiǎn)單。最簡(jiǎn)單的設(shè)置，不需要對(duì)現(xiàn)有條件修改，添加染料后進(jìn)行PCR熔解。這個(gè)簡(jiǎn)單方法允許我們，例如很快的區(qū)分apoE等位基因的所有可能情況（Fig.1A）。ApoE使用其它分型技術(shù)存在許多問(wèn)題，主要是要求每個(gè)等位基因區(qū)分開。最后，高分辨熔解曲線分析是一個(gè)閉管實(shí)驗(yàn)，染料在PCR反應(yīng)前加入更好。如果實(shí)驗(yàn)要求改變PCR條件，通�？梢栽黾渔V離子濃度2-3 μL，退火溫度增加1-5℃。當(dāng)鎂離子濃度升到設(shè)備的最大溫度以上時(shí)，加像二甲基亞砜（10%）或犢牛血清（0.5M）可以降低Tm值。對(duì)于復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，使用梯度PCR儀可以快速的確定最佳的退火溫度。
高分辨率熔解曲線分析在不同實(shí)驗(yàn)室不要求有大的改變，同時(shí)也不要特別的技術(shù)；它是在有特殊染料存在的條件下PCR條件過(guò)程進(jìn)行小的修改。最昂貴的是設(shè)備的購(gòu)買。在10,000-50,000歐元之間，根據(jù)系統(tǒng)，甚至其它一些技術(shù)相比它并不遜色。因?yàn)楦叻直媛嗜劢馇�線分析不像許多其它技術(shù)（例如，SSCA，DHPLC，DGGE,或毛細(xì)管電泳），不需要PCR后分離，更重要的是節(jié)省成本。此外，高分辨熔解曲線分析是一個(gè)非破壞性的技術(shù)，同時(shí)可以進(jìn)行后續(xù)的分析，比如，熔解分析后進(jìn)行凝膠電泳或測(cè)序。

圖1.使用高分辨熔解曲線分析檢測(cè)序列突變。A：檢測(cè)所有六個(gè)可能的ApoE等位基因組合；PCR后高分辨熔解曲線分析前添加LC-Green+染料（PCR包含10%DMSO）。ApoE 3/3等位基因作為標(biāo)準(zhǔn)（水平的灰線）。B-D：使用氨基封閉的非標(biāo)記探針檢測(cè)MBL2基因第一個(gè)外顯子的3個(gè)獨(dú)立突變(Roos et al., in preparation)。B：衍生圖全圖；C:放大的低熔解探針和D：（PCR片段）Tm峰。使用熔解圖10種等位基因可以清楚地區(qū)分。

應(yīng)用

突變檢測(cè)

    高分辨熔解曲線分析已用于DNA序列突變的檢測(cè)，是第一個(gè)用于基因分型中的技術(shù)[Wittwer等,2003]。簡(jiǎn)便、廉價(jià)、容易使用、高靈敏性和高特異性是它的突出特點(diǎn)，使它成為一種用于基因分型和診斷應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室中有吸引力的新工具。在薩普，表S1給出了我們所能找到的基于人類基因的實(shí)驗(yàn)。高分辨熔解曲線分析系統(tǒng)結(jié)合功能強(qiáng)大的軟件工具可以便利地自動(dòng)分析，然而人工檢測(cè)依然可用。目前，使用高分辨熔解曲線分析檢測(cè)突變已經(jīng)通過(guò)審查[Erali et al., 2008];因此，我們僅用于一般解釋。此外，高分辨熔解曲線分析用于人類突變的檢測(cè)已經(jīng)有多篇文章發(fā)表。充分說(shuō)明了其目前的發(fā)展水平(see also Supp. Table S1)。
    Tindall等[2009]對(duì)比了兩種設(shè)備和熒光染料，特別是高GC含量片段DNA突變的檢測(cè)。 他們說(shuō)明了高分辨熔解曲線分析的限制，謹(jǐn)慎使用它作為臨床診斷的唯一方法。Nguyen-Dumon等[2009]表明包含使用已知SNP結(jié)合稀有突變?nèi)劢馓结橈@著減少測(cè)序的能力。Van Der Stoep等[2009]類似的方法設(shè)計(jì)了覆蓋BRCA1基因的序列突變掃描，包括已知頻率SNP的熔解探針。EuroGenTest通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行評(píng)估和驗(yàn)證HRMA作為新基因篩查的準(zhǔn)則。在對(duì)28個(gè)失明患者的研究結(jié)果為100%的靈敏度、98%的特異性，假陽(yáng)性率低。Rouleau等[2009]在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用一些設(shè)備完成定量PCR和HRMA去篩查核苷酸數(shù)量（缺失/重復(fù)）和質(zhì)量的改變。最后，Dobrowolski 等[2009]描述了在兩小時(shí)之內(nèi)使用HRMA掃描16.6kb人類線粒體基因組（mtDNA）序列突變。線粒體DNA突變的識(shí)別比較復(fù)雜，因?yàn)樵S多是異質(zhì)的，同時(shí)突變等位基因以高變化率存在。事實(shí)上，作者成功地確認(rèn)在1-100%的突變存在，很好地顯示了HRMA檢測(cè)定量變化的靈敏度（見量化）
    盡管已有報(bào)道HRMA片段達(dá)600bp或更高，但我們的實(shí)驗(yàn)顯示該技術(shù)對(duì)小片段更靈敏。對(duì)于片段篩查，使用150-250bp片段，通常每個(gè)外顯子一個(gè)片段。當(dāng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的是特異突變，我們的目標(biāo)片段大小是80-100bp。我們發(fā)現(xiàn)高靈敏度的關(guān)鍵是熔解圖不會(huì)超過(guò)一到兩個(gè)熔解區(qū)域。當(dāng)片段包含了多個(gè)熔解區(qū)域，并不是所有的突變能檢測(cè)出來(lái)。目前新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化了強(qiáng)大的可用性設(shè)計(jì)項(xiàng)目，大多數(shù)情況下是和儀器一起交付。
    在早期HRMA實(shí)驗(yàn)中可以看到兩個(gè)有時(shí)甚至三個(gè)PCR產(chǎn)物熔解，可以提高結(jié)果。同樣，特別是當(dāng)DNA片段分濃度差異較大時(shí)，添加1 μL高鹽緩沖液（1.0M KCL,0.5M Tris-HCL [PH=8.0]）可以改善實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 2）。添加鹽可以提高分辨率同時(shí)促進(jìn)集群，但這種方法的成功率是不可預(yù)測(cè)的，它取決于樣品、片段和突變分析。

圖2.高鹽的影響.A:HRMA一系列樣品的分析。B：同樣的樣品在A分析后添加1 μL 1.0M kcl/0.5M Tris-HCl(PH=8.0)再熔解。留意分離的改善和三組圖像變尖。

    當(dāng)一些簡(jiǎn)單的原則都考慮到時(shí)（比如，避免長(zhǎng)片段和多重熔解域），設(shè)計(jì)一個(gè)基因的HRMA篩查非常簡(jiǎn)單。我們?cè)�成功地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)篩查MDM基因第79個(gè)外顯子90個(gè)片段(Al-Momani et al)。Nguyen-Dumont 等 [2009] 和Van Der Stoep 等[2009]表明，非標(biāo)記探針識(shí)別已知非致病突變時(shí)，不僅省時(shí)而且能夠節(jié)約成本。防止這些片段不必要的測(cè)序，同一個(gè)片段避免忽略其它突變。
    應(yīng)該指出HRMA曲線的形狀通常不足以區(qū)分一個(gè)特異突變[Tindall 等, 2009];完成這個(gè)實(shí)驗(yàn)必須添加探針或片段測(cè)序。非標(biāo)記探針區(qū)分特異探針或復(fù)等位基因的能力式驚人的。圖1B-D為例子(Roos 等，準(zhǔn)備)。使用包含野生型序列的熔解探針可以區(qū)分MBL2基因中三種相近空間突變的10種可能等位基因。
    最便宜的熔解探針3ˊ磷酸鹽封閉可以防止PCR過(guò)程中的延伸。遺憾的是，這種探針不穩(wěn)定，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)不理想的額外熔解峰。其它探針較穩(wěn)定但價(jià)格昂貴。Zhou等[2008] 使用snapback 引物完美的解決了這個(gè)問(wèn)題，它是5ˊ端引物包含了循環(huán)區(qū)域和序列互補(bǔ)其延伸產(chǎn)物，覆蓋突變篩查。 HRMA的一個(gè)缺點(diǎn)是對(duì)純合子突變的檢測(cè)。盡管隨著目前的發(fā)展分辨率已得到很大提高 [Gundry 等.,2008],  對(duì)一些突變的差異（如A-T到T-A改變）由于變化非常小所以很容易錯(cuò)過(guò)。尤其是分析不同來(lái)源的樣品，樣品到樣品的變化、實(shí)驗(yàn)噪音增加和微小的變化可能不能被檢測(cè)到。因此，序列突變篩查應(yīng)用時(shí)（臨床診斷），我們堅(jiān)持使用樣品混合產(chǎn)生異源雙鏈。首先，樣品熔解得到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的熔解曲線。下一步，使用圖表顯示（圖3為DMD設(shè)計(jì)，X軸與疾病相關(guān)），混合樣品同時(shí)產(chǎn)生第二個(gè)熔解曲線。樣品混合圖每個(gè)樣品產(chǎn)生了兩個(gè)雜交雙鏈（樣品很容易地自動(dòng)混合）。純合子將產(chǎn)生兩個(gè)雜交雙鏈，極大地提高了純合子的檢測(cè)。雜交雙鏈將通過(guò)預(yù)混的熔解曲線檢測(cè)到，盡管它們通常通過(guò)混合樣品顯而易見。（混合比例為1︰3）。當(dāng)混合相同突變樣品時(shí)，僅顯示失敗的樣品，可以通過(guò)增加更多的控制或僅混合不相關(guān)的樣品可以簡(jiǎn)單地預(yù)防 。必須指出 體系的存在可以從真正的純合子等位基因區(qū)分半合子。

圖3.生成異源雙鏈。為了確保純合子突變的檢測(cè)，可以使用顯示的方案。板孔1-12包含每個(gè)樣品（患者A-F和wt=wild-type控制）不同片段（外顯子）的PCR產(chǎn)物。第八排為空。從第一個(gè)從第七排（wt，5-10 μL PCR產(chǎn)物）樣品的一半HRMA混合開始，然后轉(zhuǎn)向第八排。隨后，第六排一半量轉(zhuǎn)向第七排，第五排一半轉(zhuǎn)向第六排等等等。最后，第八排轉(zhuǎn)向第一排，然后片段再次熔解。

    應(yīng)當(dāng)指出，HRMA檢測(cè)雜合子的靈敏度高于DNA測(cè)序。因此，當(dāng)HRMA顯示突變存在，而測(cè)序不能確認(rèn)時(shí)�？赡苁沁@個(gè)突變存在也樣品相對(duì)小的片段（體細(xì)胞嵌合體）。其它技術(shù)：如，克隆+測(cè)序或單分子稀釋+PCR和HRMA，可以確認(rèn)這些突變。

前序列篩查

    使用HRMA進(jìn)行前序列篩查，特別是對(duì)于大基因可以節(jié)省很大的成本；Provaznikova 等[2008]報(bào)道對(duì)于MYH9基因可以避免85%的測(cè)序。在例中的DMD基因，第79個(gè)外顯子需要分析(Al-Momani 等)，假定每個(gè)外顯子測(cè)序需要10歐元，篩查一個(gè)患者總共需要800歐元。每個(gè)外顯子PCR花費(fèi)1歐元，HRMA染料花費(fèi)0.1歐元，每個(gè)患者估計(jì)花費(fèi)90歐元。假定序列分析需要5個(gè)外顯子熔解需要分析（包括一個(gè)致病突變，三個(gè)非致病突變和一個(gè)假陽(yáng)性）需要增加50歐元，總花費(fèi)為140歐元。每名患者將節(jié)省650歐元，當(dāng)使用熔解探針去確定常見非致病突變存在時(shí)，將會(huì)減少更多的花費(fèi)。事實(shí)上，基于這些圖，五個(gè)外顯子基因的HRMA預(yù)篩查已經(jīng)很劃算。此外，檢測(cè)體細(xì)胞的變化或異質(zhì)性[Dobrowolski 等.2009],HRMA比測(cè)序似乎更靈敏。
 
SNP分型

    HRMA用于SNP分型有很大的吸引力。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)廉價(jià)、簡(jiǎn)單、速度快。當(dāng)在一個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)一到兩個(gè)PCR覆蓋一個(gè)SNP，至少一個(gè)通常兩個(gè)將得到很好的結(jié)果。提高靈敏度，片段必須夠�。�80-100bp），當(dāng)可以選擇時(shí)（比如：在單倍體中）應(yīng)選擇G-A突變（預(yù)計(jì)得到最大的熔解變化）[Reed 和Wittwer, 2004]。推薦添加非標(biāo)記探針[Nguyen-Dumont 等, 2009; Zhou 等,2008]，得到了雙重檢測(cè)同時(shí)提高了純合子突變檢測(cè)率。當(dāng)設(shè)定的引物到達(dá)時(shí)，不用做一到兩次的 PCR去摸索擴(kuò)增條件。檢測(cè)成本僅僅PCR費(fèi)用，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)花費(fèi)可以忽略。除非有大量的樣品需要分型，染料成本相對(duì)于實(shí)驗(yàn)成本包括具體的標(biāo)記探針（例如，TaqMan）而言比較低。HRMA樣品吞吐量可以通過(guò)使用自動(dòng)進(jìn)樣板增加，在一些系統(tǒng)中可用一些延伸或安裝一個(gè)附加的進(jìn)樣器。
    根據(jù)上面描述的陽(yáng)性結(jié)果是否重復(fù)可變數(shù)目，特別是CA重復(fù)，可以被HRMA分型（圖4）。雖然樣品所有的熔解曲線可以清楚地被區(qū)分，我們發(fā)現(xiàn)所有可能結(jié)合的等位基因很多，所以雜合子CA重復(fù)分型不能準(zhǔn)確確定。可以通過(guò)小的家族去檢測(cè)家族成員間的差異同時(shí)研究雜合子樣品的雜合性（LOH）缺失。正如Intemann等[2009]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)熔解探針的添加跨越最小的或最大的等位基因可以更大的增加分辨率。
HRMA的一個(gè)缺點(diǎn)是不能輕易應(yīng)用使用多重模式，同時(shí)進(jìn)行幾個(gè)不同片段同時(shí)分型突變。按理來(lái)說(shuō)，可以利用顏色差異，溫度差異完成多重模式。Seipp等[2008]利用最簡(jiǎn)單的方法，Tm差異成功地設(shè)計(jì)了一個(gè)四倍體基因分型實(shí)驗(yàn)。然而，這些設(shè)計(jì)時(shí)間多少和成功決定于高質(zhì)量的DNA樣品和HRMA系統(tǒng)的靈敏度使用。

圖4.  使用HRMA分析CA重復(fù)。 六個(gè)不同DNA樣品重復(fù)分析，所有的都是雜合子。上圖：歸一化溫度變化熔解3=14/17,4=14/18,5=15/21,6=14/21。

甲基化

    目前，基因組研究經(jīng)常涉及表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，尤其是CPG二核苷酸在基因表達(dá)、印記和腫瘤的甲基化(Ehrich等2006)。這些程序關(guān)鍵的步驟是基因組DNA的處理，不斷改變的非甲基化C核苷酸（不是甲基化Cs）到我們。HRMA可以應(yīng)用在這些研究中的兩個(gè)階段。首先，成功治療的前后可以通過(guò)控制的基因組片段的PCR檢測(cè)，沒有甲基化的CPGs和100%甲基化樣品樣品的熔解曲線。越接熔解圖近類似于片段100%的轉(zhuǎn)變，治療后越好[Worm等.2001]。其次，HRMA可以用于確定C-U轉(zhuǎn)變的百分率，直接用于熔解探針的結(jié)合[Maat等.2007]或克隆后。

量化— 確定鑲嵌性和拷貝變異數(shù)量
                                                                 
    根據(jù)熔解曲線變化,HRMA可以用于量化分析；較大的變化、較小的差異可以被檢測(cè)到。確定突變分子數(shù)量常用的技術(shù)為雙氧法測(cè)序（分辨率下限為20-30%）和焦磷酸化測(cè)序法（下限為1-10%）。雖然功能強(qiáng)大，焦磷酸測(cè)序法是一種勞動(dòng)密集、昂貴同時(shí)需要專門設(shè)備的方法。我們成功的應(yīng)用HRMA確定不同等位基因的數(shù)量[Aten等, 2009; Bruder等, 2008]，同時(shí)顯示檢測(cè)12.5%的步驟（1/8）通常是可以的[Aten等2009]。結(jié)腸癌中體細(xì)胞檢測(cè)的應(yīng)用見圖5。使用稀釋系列作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，可以快速確定三個(gè)疑似攜帶致病突變患者的體細(xì)胞嵌合體水平達(dá)5-10%。這些數(shù)據(jù)和通過(guò)焦磷酸測(cè)序獲得的結(jié)果完全吻合[Hes等,2008]。然而檢測(cè)費(fèi)用低廉同時(shí)易于操作。應(yīng)當(dāng)指出當(dāng)使用熔解探針時(shí)分辨率會(huì)提高到5%以下。等位基因表達(dá)差異確定的其它應(yīng)用，基于突變?cè)趍RNA中的存在和mtDNA雜合子的檢測(cè)[Dobrowolski等, 2009]。

    目前，我們使用相同的方法研究一對(duì)雙胞胎細(xì)胞攜帶體細(xì)胞缺失的片段。[Bruder等, 2008]。當(dāng)篩查患者基因組改變相關(guān)疾病時(shí)，采用該方法也可以用于確認(rèn)CNVs（缺失和重復(fù)）。根據(jù)不同的設(shè)置，像FISH、MAPH   [Armour等, 2000],  MLPA [Schouten等, 2002], MAQ [Suls等, 2006], 和 qPCR 技術(shù)可以用于確認(rèn)陣列結(jié)果。然而這幾項(xiàng)技術(shù)要么成本昂貴要么需要進(jìn)一步的發(fā)展。任何可疑區(qū)域的SNP都可以使用HRMA確認(rèn)。這些純合子樣品對(duì)于的等位基因（AA和BB）和潛在的攜帶變化的樣品1﹕1混合。假定檢測(cè)樣品攜帶了A等位基因，要么是AO,要么是AA。當(dāng)與純合子BB樣品1:1混合，缺失確定時(shí)，熔解圖樣品AA:BB以1：2的比例混合（AOBB）。當(dāng)樣品AA:BB以1：1比例混合時(shí)，缺失不存在  （AABB）。當(dāng)1：1純合子樣品BB樣品 與3：2 AA: BB樣品混合（AABB）。                                                                   

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