1. 流感病毒的形態(tài)及實(shí)驗(yàn)室分離純化：
引起人類流感的病毒是冠狀病毒。冠狀病毒只感染脊椎動物。
感染流感病毒后會引起人與動物的呼吸道、消化道與神經(jīng)系統(tǒng)病患。
流感病毒的代表型在上世紀(jì) 60年代被查明， 60年代后對各種流感病毒的完整形態(tài)已進(jìn)行了深入研究。冠狀病毒的基因圖譜序列（包括各種蛋白酶和病毒內(nèi)部的核甘酸序列）已被查明。
流感致病病毒幾何尺寸：平均直徑 100～200nm沉降系數(shù)約為 700S~800S。
病毒（全病毒）在蔗糖液中浮密度約為 1.15～1.19g/ml
病毒形態(tài)：近似球形，中心部分核酸，最外部為纖突，是血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的大分子，它附著在具有保護(hù)作用的脂質(zhì)膜上，纖突是病毒侵害人體細(xì)胞時(shí)附著道細(xì)胞上的吸附器，也是中和抗體的抗原。這二種表面抗原可以獨(dú)立或同時(shí)發(fā)生變異。 HA的變異性很強(qiáng)，是流感發(fā)生變異的主要原因。脂質(zhì)膜內(nèi)依次是膜蛋白、螺旋殼膜子粒、核酸鏈。
核酸：流感病毒的核酸為雙股線型 RNA，同種冠狀病毒的核酸序列是恒定的，但病毒發(fā)生變異后，核酸與蛋白的序列會發(fā)生某些微小變異。
病毒如何侵入人與動物細(xì)胞：纖突吸附到細(xì)胞膜上→病毒 RNA進(jìn)入人體寄主細(xì)胞→病毒核酸復(fù)制→病毒蛋白合成（包括病毒殼膜及子粒），病毒的 RNA既可以直接作為 mRNA也可以轉(zhuǎn)錄形成一個互補(bǔ)的 RNA股。病毒進(jìn)入寄主細(xì)胞后其信息通過人體細(xì)胞生物合成機(jī)制提供產(chǎn)能系統(tǒng)、核蛋白體、氨基酸活化酶、 tRNA和其他成分來指導(dǎo)合成一系列病毒蛋白。接著，病毒自身作為復(fù)制模板在特異聚合酶作用下復(fù)制，并用上述由病毒核酸指導(dǎo)合成的病毒蛋白集合成殼膜，組成一個新的病毒顆粒。
流感病毒由多個基因組片段分節(jié)段構(gòu)成，在感染細(xì)胞時(shí)，病毒基因組片段可發(fā)生重組。產(chǎn)生數(shù)百種遺傳學(xué)不同的重組子病毒亞型。這些重組病毒亞型具有父母代雙方的 RNA片段，而且多種不同的抗原變異株或重組子病毒可同時(shí)在脊椎動物中循環(huán)存在，在適應(yīng)過程中通過基因重排，交換或功能互補(bǔ)使其致病力發(fā)生改變，從而導(dǎo)致新的流行病毒株的出現(xiàn)。
全病毒分離純化：培養(yǎng)液經(jīng)層析、超濾或高速連續(xù)流離心得到濃縮全病毒的上清液。小容量可用超速離心機(jī)，最高轉(zhuǎn)速為 40,000rpm的甩平轉(zhuǎn)頭，10～50％或類似蔗糖梯度作等密度離心 30,000rpm~35,000rpm，1～2小時(shí)，5℃。病毒應(yīng)沉降在 30％～40％蔗糖梯度之間的某個位置形成純病毒區(qū)帶。用密度梯度儀（如日立 DGF-U）把管中液體自上而下用管道泵自動抽樣接至分光光度計(jì)流動池進(jìn)行光密度連續(xù)檢測，經(jīng)部分收集器分部收集并給出從管上部液面到管底的容量——光密度曲線，從曲線的尖峰位置確定病毒所在的收集離心管編號（每個離心管分批收集成 50～100管）。經(jīng)透析及其他處理后得到純病毒濃縮液。
病毒裂介后純化處理：用 Triton X-100或乙醚裂介后高速離心濃縮抗原蛋白，然后用超速離心機(jī)作密度梯度離心純化。
中試和批量生產(chǎn)：根據(jù)生產(chǎn)規(guī)�？捎玫退俅笕萘侩x心機(jī)或高速管式離心機(jī)或高速離心機(jī)高速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭、大容量層析、超濾設(shè)備、超速區(qū)帶離心，超速連續(xù)流離心直至大容量超速連續(xù)流離心機(jī)作最后分離純化。

2. 流感疫苗的應(yīng)用：
重要性：流感會引起區(qū)域甚至世界性大流行發(fā)病率和死亡率很高，對于兒童與老年人，發(fā)病率與死亡率更高。由于目前全世界各國老年人口增加比例高于其他年齡段，流感大范圍流行的后果將十分嚴(yán)重。目前唯一可行的預(yù)防措施是疫苗接種。流感全病毒滅活疫苗在全世界范圍內(nèi)使用已半個多世紀(jì)，50多年來由全病毒滅活疫苗→裂介的疫苗→亞單位疫苗已經(jīng)有了很大進(jìn)步（高度純化、熱原成分極少、注射疫苗后負(fù)作用降低……）疫苗生產(chǎn)規(guī)程： 1968年，世界衛(wèi)生組織公布了第一個流感滅活疫苗生產(chǎn)規(guī)程。（WHO TRS-384） 1973年，對以上規(guī)程作了補(bǔ)充（WHO TRS-530）。 1979年，以后幾年又對疫苗血凝素含量的測定方法作了改進(jìn)。，并進(jìn)一步修訂了規(guī)程于 79年公布了新規(guī)程（WHO TRS-638）。此后 10多年中由于生產(chǎn)廠積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，特別是連續(xù)傳代細(xì)胞系在疫苗生產(chǎn)上有了很大進(jìn)展。WHO根據(jù)當(dāng)時(shí)的實(shí)際情況又在 1989、1990、1991、1995年制定了新的流感疫苗生產(chǎn)和滅活規(guī)程。我國在 2004～2005年出版了以 95年 WHO規(guī)程為基礎(chǔ)的新規(guī)程。

3. 流感病毒的變異：
      流感病毒的流行病株多年來已發(fā)生多次變異，由于病毒毒株的變異。流感病毒（疫苗）和其他疫苗的不同之處在于毒種必須經(jīng)常改變以對付當(dāng)年流行流感病毒。因此 WHO每年要發(fā)布當(dāng)年疫苗中應(yīng)包括的毒種的建議。近年來，導(dǎo)致流感的致病病毒的抗原蛋白（血凝素及其其他蛋白）的氨基酸序列以及三維結(jié)構(gòu)都已被測定（包括 2004年流行的 SARS病毒），已經(jīng)確定血凝素分子的改變可以造成抗原性質(zhì)改變并出現(xiàn)新的流行毒株。目前的科研水平還不能預(yù)測未來的變異情況，因?yàn)樵诳乖�漂浮過程中發(fā)生的抗原變異株的選擇機(jī)制還不能認(rèn)定。變異會有很多種進(jìn)化途徑，對于未來出現(xiàn)新的血凝素亞型毒株（抗原變異）而造成新的流感爆發(fā)也是很難預(yù)測的。除了抗原變異和抗原漂移，研究還證實(shí)在流感病毒之間還存在另外一種類型的抗原變異：即在不同宿主細(xì)胞培養(yǎng)生長條件下可能會產(chǎn)生某些流感病毒的亞群。如在雞胚或鴨胚中生長的流感病毒與在傳代細(xì)胞 MDEK（狗腎）中分離和傳代培養(yǎng)的流感病毒相比，前者常會發(fā)生很小的抗原變異，對血凝素（蛋白）測序表明：在哺乳動物細(xì)胞中培養(yǎng)的流感病毒與在雞胚中培養(yǎng)的同株病毒相比，它們之間只存在單個氨基酸的替換。到目前為止造成流行的流感致病病毒，通常含有一種或多種 A（甲）型病毒，但是當(dāng) A（甲）型流感病毒出現(xiàn)一個新的亞型，即帶有新的血凝素和神經(jīng)氨基酸的抗原時(shí)，含有以往流行亞型的 A（甲）流感病毒抗原則變?yōu)闊o效。因此又必須使用含有新的流行毒株的抗原和疫苗。在世界性大流行的年代中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) A（甲）型流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨基酸抗原發(fā)生了連續(xù)不斷的抗原漂移，含有前一個流行毒株的疫苗對于后來的流感的防治效果較差。而 B（乙）型流感病毒毒株沒有發(fā)現(xiàn)亞型的變異，但有抗原變異，其變異程度比 A（甲）型病毒低得多。在多價(jià)疫苗中 B（乙）型流感病毒毒種的變化很小。因此流感疫苗中一般只含一種 B（乙）型流感毒株抗原。

4. 流感疫苗效力的測定：
      WHO規(guī)定：流感疫苗的效力以每 ml注射劑中所含有血凝素的μg數(shù)來決定。測定方法：免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。確定參考抗原和抗血凝素的特異血清。參考標(biāo)準(zhǔn)由 WHO或國家生物制品標(biāo)準(zhǔn)和鑒定研究所及國家生物制品評審和研究中心制備和分發(fā)，當(dāng)生產(chǎn)疫苗需要新毒株時(shí)，將隨時(shí)制備和提供新的參考抗原和抗血清。值得注意的是由于流感病毒的抗原變異，固定 A型和 B型病毒的抗原量是不合理的。對于不同的變異毒株，產(chǎn)生有效免疫的抗體水平所需的抗原是不一樣的。另外，疫苗接種對象的免疫應(yīng)答程度取決于年齡，是否感染過與接種疫苗相關(guān)的血凝素和神經(jīng)氨基酸蛋白抗原的免疫經(jīng)歷、劑量、接種疫苗的類型（全病毒、裂介病毒抗原或純化表面抗原）。
5.  流感疫苗的生產(chǎn)：
I.  什么是流感疫苗：流感疫苗是無菌的滅活病毒懸液，由 A（甲）型或 B（乙）型流感病毒的一株或多株或二型混合液組成，病毒在雞胚中分別單獨(dú)培養(yǎng)。流感疫苗分為三種：
     用適當(dāng)方法滅活的全病毒懸液；
     用物理化學(xué)方法部分或完全裂介處理病毒顆粒的無菌懸液（裂介疫苗）
     經(jīng)處理后主要由血凝素和神經(jīng)氨基酸抗原制成的無菌懸液（亞單位疫苗）
目前還可以通用具有表面抗原的高密度繁殖培養(yǎng)的重組病毒株生產(chǎn)的流感疫苗。
II.  血凝素參考品：當(dāng)流感在某地區(qū)或世界可能將或已經(jīng)開始流行時(shí)，WHO將流行的新病毒株列入疫苗生產(chǎn)范圍并立即發(fā)放每 ml中含有標(biāo)定的μg數(shù)的流行流感病毒的血凝素，由國家有關(guān)部門分發(fā)給各個流感疫苗的生產(chǎn)廠和檢定研究所實(shí)驗(yàn)室，用免疫擴(kuò)散法測定產(chǎn)品的血凝素抗原，并和標(biāo)定抗原進(jìn)行比較和鑒定。
III.  疫苗生產(chǎn) 嚴(yán)格按照 WHO及國家有關(guān)部門規(guī)定進(jìn)行生產(chǎn)廠的檢察及內(nèi)部裝修設(shè)計(jì)，特別注意區(qū)域隔離、滅菌消毒、設(shè)備有效性、生產(chǎn)人員的安全保證等等。
嚴(yán)格控制生產(chǎn)原材料：只有經(jīng)過國家監(jiān)控部門批準(zhǔn)的毒株方可用于生產(chǎn)。滅活流感疫苗用的病毒株必須有經(jīng)鑒證的記錄（原始株及后續(xù)處理資料；用于高產(chǎn)表達(dá)表面抗原的重組株病毒在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生抗原變異，因此必須用血凝素單克隆抗體試驗(yàn)或動物免疫血清血凝抑制試驗(yàn)證明無此抗原變異。
種子批：疫苗生產(chǎn)只能用工作種子批，工作種子批只能傳一代，種子批病毒必須確認(rèn)不含外源性活微生物（如用雞胚制備的種子批必須確認(rèn)無雞白血病病毒和腺病毒）。液態(tài)種子批儲存在－60℃以下，凍干品保存在－20℃以下。
病毒繁殖：用于生產(chǎn)流感滅活疫苗的流感病毒用雞胚培養(yǎng)，雞蛋應(yīng)來自健康雞群并經(jīng)國家有關(guān)部門批準(zhǔn)。用工作種子批病毒對每個雞胚尿囊腔注射 0.2ml， 33℃～37℃培養(yǎng) 3天。培養(yǎng)后只能收獲雞胚尿囊液和羊水，不允許在任何過程中使用含有β－丙酰胺的抗生素（允許使用其他微量適宜的抗生素）如果疫苗用裂介病毒制成，裂介條件、使用的化學(xué)試劑品種及濃度必須經(jīng)國家批準(zhǔn)。
滅活：單價(jià)病毒合并液在制成后應(yīng)盡快滅活，滅活前保存于 5℃±3℃不超過 5天。在滅活前應(yīng)檢查有無細(xì)菌或霉菌污染。滅活方法經(jīng)國家批準(zhǔn)且必須能殺滅雞白血病病毒和支原體。【如使用福爾馬林（40％甲醛）或β－丙烯內(nèi)脂，濃度不能超過 0.1％】。滅菌后病毒合并液儲存于 5℃±3℃。
濃縮和純化：一般用超速離心法（超速區(qū)帶離心或超速連續(xù)流離心）可以在滅菌前或滅菌后進(jìn)行。濃縮或純化過程中應(yīng)最大程度地保護(hù)血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原。
產(chǎn)品鑒定：要進(jìn)行表面抗原濃度測定、抗原鑒別試驗(yàn)、滅菌試驗(yàn)、總蛋白量測定（蛋白含量不得超過血凝素含量 6倍，但在任何情況下，一個人份劑量的一個毒種蛋白量不超過 100μg，一個人份總蛋白量不超過 300μg）、卵白蛋白測定（一個人份劑量卵白蛋白含量不得超過 5μg，可以低于 1μg）、血凝素測定（一個人份劑量中血凝素含量為 7～20μg，按標(biāo)簽上的血凝素含量，實(shí)際含量應(yīng)在 80％至 120％之間；還要用鱟試劑做內(nèi)毒素測定。
附件：
一些有關(guān)的術(shù)語：
母種子批：（Master seed lot）:從 WHO推薦的一株病毒在同一時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)得到的一定數(shù)量的同一成分的病毒。母種子批用于制備工作種子批。毒種母種子批及其傳代代數(shù)均由國家有關(guān)部門批準(zhǔn)。
工作種子批:（Working seed lot）:由毒種母種子批培養(yǎng)所得到的一定數(shù)量的病毒為同一成分病毒，經(jīng)過全面鑒定。病毒傳代代數(shù)不得超過國家檢定當(dāng)局批準(zhǔn)的最長代數(shù)，工作種子批用于疫苗生產(chǎn)。
單一收獲物：（Single harvest）:用同一毒株同時(shí)接種并同時(shí)收獲的一定數(shù)量的病毒液。
單價(jià)病毒合并液：用同一病毒株在同一時(shí)間生產(chǎn)的一定數(shù)量的單一收獲液的合并液。
半成品：（Final bulk）:將一批或數(shù)批單價(jià)病毒合并液置于一容器中并由此分裝到疫苗瓶中。半成品可以含有一個或數(shù)個病毒株。
成品批：一批已分裝并封口的疫苗瓶，在分裝過程中受污染的危險(xiǎn)性是相等的。因此，成品批必須是由一批半成品在同一工作程序中分裝的疫苗。