禽流感病毒的分離、鑒定和診斷

YU.05.1

一、什么是禽流感？

禽流感（AI）是由A 型流感病毒（AIV ）引起的禽類疾病綜合癥。禽類感染AIV 后表現(xiàn)為：輕度上呼吸道感染、精神萎縮、食欲減退，有類似人類A 型流感的癥狀。初期還會引起肉用雞停止增重，蛋雞產(chǎn)蛋量大大下降，種蛋孵化率下降等。發(fā)病很急，很短時間就會發(fā)展到全身致死性疾病綜合癥。AIV 廣泛存在于家禽和野生禽類，臨床癥狀易與ND （Newcastle disease, 新城病毒）、IB（雞傳染性支氣管炎）、EDS-76 （病毒引起的雞產(chǎn)蛋下降綜合癥）相混淆。雖然AI 的毒株大部分都不是高致病力毒株，但由于A 型禽流感的抗原（特別是血凝素抗原）易發(fā)生變異，變異后的毒株會變成高致病力的病毒，造成嚴(yán)重危害。此外AI 還會傳染給高危人類（如飼養(yǎng)者，運(yùn)輸者，禽醫(yī)，禽類流行病專家等），造成人類禽流感，其危害更大。

二、歷史：

人類在十九世紀(jì)前對禽流感沒有深入認(rèn)識和研究，當(dāng)時禽類飼養(yǎng)也沒形成大規(guī)模企業(yè)生產(chǎn)，一般小型飼養(yǎng)戶把AI 統(tǒng)稱為禽類瘟病，流行也是局部的，危害有限。但1878 年，意大利的AI 大規(guī)模流行（可能是高致病力毒株引起）到百年以后1983－84 年美國大流行（已經(jīng)確認(rèn)是高致病力毒株H5N2 引起）再到2004 年亞洲→美洲的大流行表明AI 發(fā)生了變異，它是由AIV 的纖突中血凝素（HA）的抗原發(fā)生變異形成的，和人類A（甲）型流感一樣，僅僅是HA 抗原蛋白的一個氨基酸發(fā)生了變異就使得毒株的致病力發(fā)生了很大的變化。

現(xiàn)在，對禽流感的認(rèn)識已經(jīng)前進(jìn)了一大步，AIV 的蛋白質(zhì)、酶、和核酸種類及序列已被查明。禽流感疫苗已在各國生產(chǎn)。對AIV 的生物學(xué)診斷技術(shù)的研究已發(fā)展到了分子生物所階段。在我國，正在研究制訂流行病學(xué)檢測方法和制訂早期快速診斷技術(shù)規(guī)程。

三、AIV 的分離、鑒定和診斷：

I. 分離純化和觀測：

采集氣管粘液或泄殖腔粘液，或病變組織（呼吸道、消化道），加純水制作勻漿（10％ 懸液），低速冷凍離心機(jī)（臺式或立式均可）3,000~4,000rpm, 4℃～5℃，15～20 分，棄沉淀，即得到粗制的病毒液，可用負(fù)染法處理（用毛細(xì)管吸取懸液，滴在帶有支持膜的銅網(wǎng)上，根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度可立即或放置數(shù)分鐘后，用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，然后滴上負(fù)染液（常用重金屬鹽配置：如PTA（磷鎢酸）、KPT（磷鎢酸鉀）、NaPT ( 磷鎢酸鈉)、醋酸鈉、甲酸鈉、鉬酸銨等等）、染色時間1～2 分鐘，然后用濾紙吸去染液，待干燥后上透射電鏡觀測。

如果粗制液中病毒成份極少，透射電鏡觀測不到，則可把懸液用離心濃縮儀濃縮；或用超速離心機(jī)，固定角式轉(zhuǎn)頭40,000rpm ×45 分鐘，5℃取沉淀制成懸液上電鏡觀測�；蛴�40,000rpm 的甩平轉(zhuǎn)頭，30％～50％W/W 線性蔗糖梯度32,000rpm×50 分，5℃，病毒集聚在1.15～1.18g/cm³ 之間的某個位置形成純樣品區(qū)帶；或用Ficoll,30％～40％W/W 線性梯度，病毒沉降在1.13～1.15 g/cm³ 之間；或用Percoll 作平衡等密度離心，自形成梯度，病毒懸液與Percoll 混合，初始密度1.05 g/cm³，用0.01M Tris-HCL 作滲透平衡液，超速離心甩平轉(zhuǎn)頭P28S（日立）或SW28（貝克曼）轉(zhuǎn)頭，20,000rpm×30 分鐘，5℃。病毒在1.06 g/cm³ 附近形成純樣品區(qū)帶。當(dāng)然，也可以用溴化鈉（鉀）或碘化鈉（鉀）梯度進(jìn)行禽流感病毒的純化。

對于一般單位，由于設(shè)備限制為了達(dá)到分離鑒定的目的可用下面程序：

病毒組織低速離心后的懸液，經(jīng)過離心濃縮儀處理濃縮到原來體積的1/3~1/4 后接種于9～11 日齡雞胚，每個雞胚注射0.2ml,35℃±2℃培養(yǎng)三天。收集尿囊液及羊水測定其血凝活性，若為陰性則繼續(xù)盲傳2～3 代，對具有血凝活性的尿囊液先用ND（核抗原）抗血清作HI 試驗以排除新城病毒（New Castle Virus ）的可能性。ND 陽性的樣品也要采用中和法傳代， 看看是否為ND 與AIV 混合感染。然后用免疫法來檢測特異性核抗原NP 或MP，接著用血凝抑制試驗和神經(jīng)氨酸酶抑制試驗來鑒定A 型禽流感病毒亞型。分離鑒定的同時還要進(jìn)行致病力試驗，確定毒力強(qiáng)弱。

和人類流感致病病毒一樣，病毒的分離、純化、鑒定、診斷都是比較復(fù)雜的操作，但對于哺乳類脊椎動物來說，致病病毒有相當(dāng)多具有構(gòu)造相似、分離純化方法也基本相同，但診斷技術(shù)就常有較大的差異。

純化的病毒可用透射電鏡作進(jìn)一步觀察研究，一般用負(fù)染或超薄切片選擇較小的物鏡光闌（增加反差），較高的加速電壓（80～100）KV，放大倍數(shù)一般為15 萬～20 萬倍，可以清晰地觀察到病毒形態(tài)。

病毒裂介和進(jìn)一步對血凝素，神經(jīng)氨酸酶，RNA 及其他蛋白質(zhì)，酶進(jìn)行分離純化后，可進(jìn)行病毒的部分基因或全基因序列測定，以鑒定病毒的變異程度和生產(chǎn)有效的疫苗。

II. 禽流感診斷技術(shù)：
禽流感診斷技術(shù)可分為血清學(xué)診斷技術(shù)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。

①
血清學(xué)診斷技術(shù)

l HA( 血凝素)HI（血凝素免疫）試驗：常用于AIV 的HA 亞型鑒定的方法。試驗繁瑣，特異性好。但由于用已知HA 型的血清不能檢出新的HA 亞型的AIV，所以該方法有一定局限性。l 神經(jīng)氨酸酶抑制試驗：（NW）：用于AIV 另一種表面抗原，即神經(jīng)氨酸酶的亞型鑒別。80 年代后期已逐漸采用96 孔板微量NIT 試驗法，此法不僅可降低Ag（抗原）用量，而且可以對多種分離物進(jìn)行Ag 分類。WHO（世界衛(wèi)生組織）推薦此法用于NA 亞型分類。用1－9 型NA 抗血清加入各種試劑，經(jīng)實驗處理后用顏色來鑒別NI 的陽性和陰性。根據(jù)結(jié)果可判斷AIV 的NA 亞型。注意，為了避免病毒擴(kuò)散污染危險，HA,HI,NIT 試驗都必須在P2~P3 級試驗室進(jìn)行。

l  病毒中和試驗（VNT）:試驗操作繁瑣，臨床上很少使用，但作為經(jīng)典方法，它可以作為其他新的檢測方法的比較標(biāo)準(zhǔn)。

l  瓊脂凝膠擴(kuò)散試驗（AGP）：AGP 是在瓊脂凝膠中進(jìn)行的抗原抗體免疫沉淀反應(yīng)。簡便、快捷，既可定性又可以定量，70 年代以后開始將AGP 用于禽流感Ab 檢測。由于禽流感不同亞型均具有共同的型特異性Ag，保守性很強(qiáng)，基本不發(fā)生變異，所以可以用一種禽流感的Ag 或Ab 對所有A 型AIV 的Ab 及Ag 進(jìn)行檢測。AGP 常用免疫雙擴(kuò)散法。Ag 制備法可參考三I 節(jié)的懸液制備或用超速離心濃縮純化，福爾馬林滅活制備Ag 效果很好。在瓊脂板中加入3％的PEG-6000，可以提高AGP 的敏感性。除以上方法外，免疫單輻射擴(kuò)散試驗、單輻射溶血試驗，對流免疫電泳等也常用于AIV 及其Ab 的檢測。但這幾種試驗都需在凝膠中進(jìn)行，敏感性差。AGP 所需試劑及Ag，Ab 量較大，限制了它的使用。

l  免疫熒光技術(shù)（IFT）：60 年代開始用于人流感快速診斷，80 年代美國爆發(fā)了禽流感時，將IFT 首次用于AIV 檢測。診斷時應(yīng)注意避免或降低樣品中出現(xiàn)的假陽性，即非特異性熒光問題。

l  酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：80 年代開始用于AIV 亞型檢測，20 年來各國學(xué)者對此法進(jìn)行了多種研究和改進(jìn)，已有試劑盒出售。目前ELISA 已成為AI 流行病學(xué)普查及早期快速診斷最有效，最實用的方法。

② 分子生物學(xué)診斷技術(shù)： 近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已被大量應(yīng)用于AI 的快速診斷。PCR ，和我國學(xué)者創(chuàng)建的逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)即RT-PCR 具有高度特異性和靈敏性。此外，用單克隆抗體在免疫過氧化酶染色組織中定位病毒抗原；基因探針原位染交可定位組織中參與病毒復(fù)制的感染細(xì)胞；核酸分子雜交可檢測病毒的核酸等等都有很好的應(yīng)用前景。

四、展望：

    目前我國學(xué)者正在研究和完善禽流感的早期快速診斷技術(shù)和流行病學(xué)檢測方法，已經(jīng)在制定AI 診斷規(guī)程和防疫條例，并建立全國性的AI 檢測和預(yù)防網(wǎng)絡(luò)。

作者：余興明   電話：13764301893,